ROS在白藜蘆醇誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬中的作用.pdf

1、目的:探討白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116自噬過程中，ROS發(fā)揮的作用。同時(shí)研究RSV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過程中ROS、p53、NQO1等的相關(guān)性及其相互調(diào)節(jié)，以了解ROS在RSV誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬中的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為白藜蘆醇治療結(jié)腸癌的研究提供充分可靠的理論支持。
　　方法:
　　1用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，待其生長至培養(yǎng)皿的80％左右時(shí)，應(yīng)用ROS清除劑(NAC)

2、預(yù)先對(duì)其進(jìn)行處理1h，再用不同劑量的白藜蘆醇處理細(xì)胞24h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量的變化。其中培養(yǎng)基含有10％的澳洲胎牛血清。
　　2運(yùn)用MTT法檢測藥物處理細(xì)胞后的生存率的改變。同時(shí)運(yùn)用NBB法檢測NAC與白藜蘆醇共同處理組和只加白藜蘆醇組細(xì)胞生存率變化的比較。
　　3應(yīng)用單丹磺酰戊二胺(MDC)法檢測藥物處理細(xì)胞后的酸性自噬泡的變化。
　　4應(yīng)用DAPI染色法檢測不同藥物處理細(xì)胞后的細(xì)胞核和染色質(zhì)的變化

3、。
　　5不同藥物處理HCT116細(xì)胞和SIRNA技術(shù)沉默p53后，Western blot法檢測后，自噬相關(guān)蛋白以及p53，NQO1，Nrf2等蛋白的表達(dá)情況。
　　6流式細(xì)胞術(shù)法檢測不同劑量的白藜蘆醇和雙香豆素作用細(xì)胞24h后的ROS變化趨勢。
　　7應(yīng)用SPSS13.0處理實(shí)驗(yàn)過程中的多次重復(fù)和對(duì)照的結(jié)果，且均采用t檢驗(yàn)的方法分析，最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，如果P＜0.05則說明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

4、br>　　結(jié)果:
　　1首先用不同劑量藥物(0-200μM)作用于HCT116細(xì)胞后，MTT的結(jié)果顯示細(xì)胞的存活率會(huì)隨著藥物濃度的升高而減低。此外，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不同劑量的藥物(0-150μM)處理HCT116細(xì)胞24h后，隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞也會(huì)隨之發(fā)生變化。主要表現(xiàn)為鏡下細(xì)胞的觸角逐漸減少，相互之間的空隙增大，數(shù)目越來越少。同樣，100μM白藜蘆醇作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116不同的時(shí)間(0，12，24，48h)后，

5、細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的改變與濃度組的改變趨勢基本相同。
　　2應(yīng)用DAPI法和Western Blot法檢測濃度組和時(shí)間組的細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞并沒有明顯的凋亡現(xiàn)象。經(jīng)過MDC試劑染色發(fā)現(xiàn)，不同劑量的白藜蘆醇作用于HCT116后，隨著白藜蘆醇劑量的增加，自噬泡的數(shù)量也會(huì)隨之增多。同時(shí)運(yùn)用Western Blot法對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)均隨著藥物劑量的增加而升高，同時(shí)抗凋亡有關(guān)的蛋白bcl-2和凋

6、亡有關(guān)的Bax也是呈升高趨勢，且bcl-2/Bax的比值在一定范圍內(nèi)也是有升高趨勢的。此外，應(yīng)用白藜蘆醇處理HCT116不同時(shí)間(0，12，24，48h)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象與不同劑量組的自噬現(xiàn)象基本相同。這些結(jié)果都提示了HCT116細(xì)胞內(nèi)有自噬現(xiàn)象的出現(xiàn)。
　　3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的白藜蘆醇作用于HCT116后，隨著藥物劑量的增加，ROS的總體含量也會(huì)隨之升高。
　　4經(jīng)過NBB法檢測顯示，

7、白藜蘆醇與NAC共同處理細(xì)胞組和白藜蘆醇組的細(xì)胞都會(huì)受到白藜蘆醇劑量的影響，細(xì)胞生存率均下降，但是兩種藥物共同處理組的生存率會(huì)高于白藜蘆醇組的細(xì)胞生存率。倒置顯微鏡觀察顯示，兩種藥物共同處理組的細(xì)胞存活數(shù)多于白藜蘆醇組的細(xì)胞數(shù)。
　　5經(jīng)過MDC試劑染色發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇與NAC共同處理細(xì)胞后，自噬泡數(shù)量比白藜蘆醇組的自噬泡數(shù)量要少。Western Blot法檢測，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與NAC共同處理細(xì)胞后，各個(gè)蛋白的表達(dá)量均會(huì)低于白藜蘆醇組

8、的表達(dá)量。
　　6經(jīng)過Western Blot法觀察，ROS清除劑(NAC)、p53激動(dòng)劑(Nutlin-3)、抑制劑(PFT-α)和NQO1活性抑制劑（雙香豆素）分別和白藜蘆醇一起處理HCT116后，NAC、PFT-α和雙香豆素組的蛋白表達(dá)量顯著低于白藜蘆醇組蛋白的表達(dá)量，Nutlin-3組的蛋白表達(dá)量會(huì)高于白藜蘆醇組的蛋白表達(dá)量，雙香豆素組的LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)量明顯高于白藜蘆醇組蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)論:<