貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響及其自噬的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　結(jié)腸癌(colon cancer)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升。結(jié)腸癌的治療一般以手術(shù)治療為主，并配合化學(xué)治療以及靶向治療，但患者尤其是晚期結(jié)腸癌患者的生存及預(yù)后不甚理想。中醫(yī)藥在結(jié)腸癌的治療中具有一定療效，可以通過(guò)降低結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)率，改善患者的生存質(zhì)量，但臨床治療效果個(gè)體差異較大，作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，中藥提取物貝母素乙（peiminine）在體外實(shí)驗(yàn)

2、中能夠明顯抑制人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)，因此，本研究擬繼續(xù)研究貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，并觀察貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞自噬的作用，明確該單體對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的分子作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，為該藥物的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.采用Affymetrix公司的PrimeView?Human Gene Expression Array基因表達(dá)譜芯片探究中

3、藥提取物貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。將實(shí)驗(yàn)分為貝母素乙組和對(duì)照組，分別干預(yù)人結(jié)腸癌 HCT-116細(xì)胞后，提取總RNA，隨后基因芯片雜交步驟按照北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供的基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)操作流程進(jìn)行，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
　　2.將穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，用不同濃度（0uM、50uM、100uM、200uM）的貝母素乙作用該細(xì)胞，對(duì)照組用相同體積的DM

4、SO處理，使用共聚焦顯微鏡觀察自噬現(xiàn)象；將不同處理的貝母素乙作用HCT-116細(xì)胞，即5個(gè)給藥濃度（0 uM，50uM，100uM，200 uM，400uM）和五個(gè)給藥時(shí)長(zhǎng)(0小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí))，蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.篩選出37個(gè)差異基因，貝母素乙組和對(duì)照組比較，顯著上調(diào)5個(gè)，下調(diào)32個(gè)。經(jīng)過(guò)GO（Go Ontology）富

5、集分析，差異基因主要集中在生物學(xué)過(guò)程和分子功能方面，而在細(xì)胞組分方面無(wú)明顯差異；在生物學(xué)過(guò)程中差異基因主要集中在熱生成調(diào)控、運(yùn)動(dòng)行為調(diào)控、尿嘧啶核苷代謝過(guò)程、腎上腺素能受體信號(hào)通路的調(diào)控、脂肪組織代謝的調(diào)控和 G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路的調(diào)控；在分子功能方面表現(xiàn)為腎上腺素能受體結(jié)合活性和尿嘧啶核苷磷酸化酶活性。經(jīng)過(guò)KEGG富集分析，差異表達(dá)基因主要集中在藥物代謝酶、嘧啶代謝、酮體合成和降解、維生素B6代謝、核糖體方面。
　　2.在共聚

6、焦顯微鏡下，可以明顯觀察到貝母素乙組中多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)聚集成團(tuán)塊狀，形成自噬斑，而對(duì)照組呈散點(diǎn)狀分布，且隨著貝母素乙濃度的升高，自噬細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)，與對(duì)照組相比，200 uM和400uM的貝母素乙以及200 uM的貝母素乙處理細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí))，LC3B-II/LC3B-I比值及SQSTM1（p62）均成顯著升高的趨勢(shì)（P＜0.05）。

7、>　　結(jié)論：
　　從基因?qū)用娴慕Y(jié)果提示差異表達(dá)基因有37個(gè)，這些基因的變化均可能是貝母素乙抗腫瘤作用的靶點(diǎn)，主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞增殖、氟尿嘧啶代謝通路的影響、能量代謝、對(duì)YY1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控四個(gè)方面。其中YY1基因的上調(diào)，共聚焦顯微鏡觀察到自噬斑，蛋白免疫印跡法檢測(cè)到自噬蛋白LC3B-II、SQSTM1（p62）的表達(dá)，均提示貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌 HCT-116細(xì)胞的作用與自噬相關(guān)，有利于貝母素乙藥理活性的深入研究，為浙貝母抗腫瘤的臨床