5-Fu誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT-116細胞自噬與凋亡的關(guān)系及機制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有明顯上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多途徑、多因素共同作用的復(fù)雜過程。當(dāng)前以外科手術(shù)為中心的多學(xué)科綜合治療是結(jié)直腸癌最有效的治療手段，但這些療法都存在著一定的局限性，不能達到徹底根治腫瘤的目的。特別是在化療過程中常會出現(xiàn)腫瘤細胞耐受的現(xiàn)象，逃逸凋亡而達不到理想的治療效果。自噬是區(qū)別于細胞凋亡的另一種細胞程序性死亡路徑，當(dāng)前自噬與5-Fu誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡之

2、間的關(guān)系及作用機制正成為結(jié)腸癌治療的一個新熱點。自噬和凋亡作為兩種不同程序性細胞死亡途徑，二者的信號通路在某些環(huán)節(jié)可能存在交叉，因此對其機制的研究，可為結(jié)腸癌化療治療敏感性藥物開發(fā)和有效利用提供新的線索和途徑。
　　 一、5-Fu誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞HCT-116自噬與凋亡
　　 目的:研究5-Fu誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細胞系自噬和凋亡的可能性。
　　 方法:培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-116細胞，分為對照組及不同時點的5-

3、Fu處理組(6h，12h，24h)，通過MTT法檢測不同處理組細胞增殖情況，通過MDC染色法檢測HCT-116細胞自噬的水平，通過western blot法檢測自噬相關(guān)基因beclin1、LC3B的表達水平，評價5-Fu誘導(dǎo)HCT-116細胞自噬的能力;通過DAPI染色法觀察5-Fu誘導(dǎo)HCT-116細胞凋亡情況，流式細胞術(shù)定量5-Fu處理細胞后凋亡水平，結(jié)合western blot檢測凋亡相關(guān)基因p53的表達情況，評價5-Fu誘導(dǎo)HC

4、T-116細胞凋亡的能力。
　　 結(jié)果:隨著5-Fu劑量的增加，與對照組比較，各組吸收光密度值明顯低于對照組（P＜0.05），隨著5-Fu作用時間的延長，各組細胞增殖抑制率顯著上升(P＜0.05)。5-Fu處理HCT-116細胞后，經(jīng)MDC染色，于熒光顯微鏡下可見點狀分布的自噬囊泡。自噬囊泡數(shù)目在12h達到最大值，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。自噬相關(guān)基因beclin1及LC3B蛋白表達水平逐漸升高，至12h達到最大

5、值，與對照組相比顯著升高。DAPI染色可見5-Fu作用細胞后細胞核染色質(zhì)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變;5-Fu作用細胞后6h凋亡率9.1％，12h組凋亡率19.5％，24h組凋亡率44.0％，顯著高于對照組細胞凋亡率4.0％（P＜0.05）;凋亡相關(guān)基因p53蛋白水平表達，隨時間延長而逐漸升高，至24h達到最大值，與對照組相比具有顯著性差異。
　　 結(jié)論:5-Fu處理人結(jié)腸癌細胞HCT-116后可誘導(dǎo)自噬與凋亡。
　　 二、自噬在5-

6、Fu誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞HCT-116凋亡中的作用
　　 目的:研究5-Fu聯(lián)合自噬抑制劑(3-MA)、自噬誘導(dǎo)劑(Rapamycin)及泛凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK)作用HCT-116細胞后，對細胞增殖、凋亡及自噬、凋亡相關(guān)基因水平表達的影響。
　　 方法:采用MTT法檢測不同處理組細胞增殖的情況，通過流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡的水平，熒光實時定量PCR法檢測不同處理組細胞自噬和凋亡相關(guān)基因mRNA的表達水平。

7、　　 結(jié)果:5-Fu聯(lián)合3-MA、Rapamycin及Z-VAD-FMK分別作用HCT-116細胞，與對照組相比，隨著作用時間延長(6h，12h，24h，48h)，細胞吸光度顯著降低（P＜0.05），細胞增殖抑制率顯著增高（P＜0.05）。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，與對照組（0.73±0.59％）相比，Rapamycin組（13.20±0.78％）凋亡率顯著增高（P＜0.05），不同用藥方式間比較，Rapamycin組（13.20±0

8、.78％）凋亡率顯著高于3-MA組（5.25±1.77％）及Z-VAD-FMK組（2.83±0.97％）;與對照組相比，5-Fu組（21.76±2.14％）、5-Fu聯(lián)合3-MA組（15.45±1.57％）、5-Fu聯(lián)合Rapamycin組（28.37±1.72％）及5-Fu聯(lián)合Z-VAD-FMK組（10.70±1.04％）凋亡率均顯著增高（P＜0.05）;不同處理方式間比較，5-Fu聯(lián)合Rapamycin組凋亡率顯著高于單獨應(yīng)用5-F

9、u組（P＜0.05），5-Fu聯(lián)合3-MA組及5-Fu聯(lián)合Z-VAD-FMK組凋亡率顯著低于單獨應(yīng)用5-Fu組(P＜0.05)。與對照組比較，其它各組beclin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高(P＜0.05);4種不同處理方式之間，除5-Fu組和5-Fu聯(lián)合Z-VAD-FMK組無顯著差異外，余各組間均具有顯著性差異（P＜0.05）。與對照組比較，5-Fu組及5-Fu聯(lián)合Rapamycin組LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高（P＜0.0

10、5）;4種不同處理方式之間，與單獨應(yīng)用5-Fu組相比，5-Fu聯(lián)合Rapamycin組LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高(P＜0.05)，5-Fu聯(lián)合3-MA組及5-Fu聯(lián)合Z-VAD-FMK組LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低(P＜0.05)。與對照組比較，5-Fu組及5-Fu聯(lián)合Rapamycin組p53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高(P＜0.05)，4種不同處理方式之間，與單獨應(yīng)用5-Fu組相比，5-Fu聯(lián)合Rapamycin組p5

11、3mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增高(P＜0.05)，5-Fu聯(lián)合3-MA組及5-Fu聯(lián)合Z-VAD-FMK組轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:與單獨應(yīng)用5-Fu相比，5-Fu聯(lián)合自噬誘導(dǎo)劑能夠抑制HCT-116細胞增殖，同時促進細胞凋亡，5-Fu聯(lián)合自噬抑制劑產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)與之相反，5-Fu聯(lián)合自噬誘導(dǎo)劑及自噬抑制劑不僅可影響自噬通路，同時也對凋亡通路起作用。
　　 三、beclin1基因在5-Fu誘導(dǎo)HCT-1

12、16細胞自噬與凋亡中的作用
　　 目的:建立beclin1基因過表達模型和干擾模型，探討beclin1基因過表達及干擾下對HCT-116細胞增殖、凋亡、自噬與凋亡基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達水平的影響。
　　 方法:通過構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-beclin1及pGenesil1.3-beclin1Ri，用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HCT-116細胞中，采用western blot檢測beclin1蛋白表達情況。利

13、用MTT法檢測各組間細胞增殖的情況，通過流式細胞術(shù)檢測各組間細胞凋亡水平，熒光定量PCR法檢測各組間自噬與凋亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化，western blot檢測各組間自噬與凋亡蛋白表達水平的變化。
　　 結(jié)果:隨著作用時間的延長，與對照組相比，各組細胞OD值明顯降低，細胞增殖抑制率顯著增高(P＜0.05);與HCT-116+5-Fu組、beclin1Ri+5-Fu組比較，beclin1過表達+5-Fu組抑制率顯著增高(P

14、＜0.05)。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，與對照組比較，6h、24h各組凋亡率均顯著上升(P＜0.05);與HCT-116+5-Fu組比較，beclin1過表達+5-Fu組凋亡率顯著上升（P＜0.05）。5-Fu作用beclin1過表達HCT-116細胞，beclin1蛋白表達水平隨時間延長而逐漸增加，48h達到最高值;5-Fu作用beclin1干擾HCT-116細胞，beclin1蛋白表達水平在6h達到最低值后，12h開始上升，24h達到

15、最大值，48h表達下降，但仍高于對照組;5-Fu作用HCT-116細胞，beclin1蛋白表達水平6h出現(xiàn)升高，12h表達量至最大值，24h及48h表達量下降，但仍高于對照組。與對照組比較，5-Fu作用后各時點各組LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高(P＜0.05);5-Fu作用后12h、24h及48h，beclin1基因過表達組與其他各組比較，LC3B mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高(P＜0.05);5-Fu作用beclin1過表達HCT

16、-116細胞，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達比隨時間延長而逐漸增加，48h達到最高值;5-Fu作用beclin1干擾HCT-116細胞，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達比在6h達到最低值后，12h開始上升，24h達到最大值，48h表達下降，仍高于對照組;5-Fu作用HCT-116細胞，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達比6h出現(xiàn)升高，12h至最大值，24h及48h比值下降，但仍高于對照組。5-Fu作用后6h、12h、24h及48h，各處理組p53mRNA

17、的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對照組;beclin1基因過表達組與其他各組比較，各時點p53mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高（P＜0.05）。5-Fu作用beclin1過表達HCT-116細胞，p53蛋白表達量隨時間延長而逐漸增加，至48h達到最大值;5-Fu作用beclin1干擾HCT-116細胞，p53蛋白表達量在6h后開始升高，至24h達到最高值，48h表達量減少，仍高于6h表達水平;5-Fu作用HCT-116細胞，p53蛋白表達量在6h后開始升

18、高，隨著時間的延長表達量逐漸升高，在48h達到最大值。
　　 結(jié)論:自噬相關(guān)基因beclin1過表達可抑制HCT-116細胞增殖，同時可促進細胞凋亡，LC3B及p53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，beclin1、LC3Ⅱ和p53蛋白表達水平增加，;beclin1基因干擾后，HCT-116細胞增殖增多，抑制細胞凋亡，LC3B及p53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，beclin1、LC3Ⅱ和p53蛋白表達量減少，LC3B及p53 mRNA轉(zhuǎn)錄