5-Aza-CdR聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2凋亡的影響.pdf

1、目的： （1）檢測(cè)四株人結(jié)腸癌細(xì)胞株中p16基因甲基化狀態(tài)。 （2）觀察p16基因甲基化的結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2在去甲基化制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理前后對(duì)其生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象、對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性以及5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性方面的變化，為結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)制和聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。 方法：采用MSP法檢測(cè)四株不同的人結(jié)腸癌細(xì)胞株中p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，應(yīng)用不同濃

2、度（0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L以及5μmol/L）的5-Aza-CdR處理人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2，觀察處理前后p16基因mRNA表達(dá)水平的變化情況；采用四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）檢測(cè)5-Aza-CdR及5-FU對(duì)細(xì)胞株Caco-2的生長(zhǎng)抑制作用、RT-PCR及western-blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bax，bnip3，bcl-2的表達(dá)變化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況的變化以及Giems

3、a染色普通光學(xué)顯微鏡及Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察去甲基化處理前后的細(xì)胞株在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的改變。 結(jié)果： （1）采用MSP方法檢測(cè)四株結(jié)腸癌細(xì)胞株中p16基因的甲基化狀態(tài)，p16基因在Caco-2及RKO細(xì)胞株中啟動(dòng)子區(qū)呈完全甲基化狀態(tài)；在SW480及HCT116中呈半甲基化狀態(tài)。 （2）采用四種不同濃度5-Aza-CdR（0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L以及5μm

4、ol/L）處理人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-272h后，可檢測(cè)出p16mRNA表達(dá)。MSP結(jié)果顯示，經(jīng)1.25μmol/L、2.5μmol/L及5μmol/L5-Aza-CdR處理后同時(shí)檢測(cè)出甲基化及非甲基化引物擴(kuò)增的產(chǎn)物。 （3）5-Aza-CdR及5-FU處理后的Caco-2細(xì)胞株生長(zhǎng)速度均明顯慢于正常組（P<0.01）。 （4）5-Aza-CdR對(duì)5-FU誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞的早期凋亡隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加；5-Aza-C

5、dR聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡的作用優(yōu)于兩者單純相加，具有協(xié)同作用（P<0.05）。 （5）5-Aza-CdR聯(lián)合5-FU處理組中Caco-2細(xì)胞株可觀察到細(xì)胞凋亡所特有的典型形態(tài)學(xué)特征。 （6）RT-PCR及western-blotting均顯示聯(lián)用藥組凋亡相關(guān)基因bax及bnip3表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.01），bcl-2的表達(dá)明顯減弱（P<0.01）。 結(jié)論： （1）p16在人結(jié)腸癌細(xì)胞株C

6、aco-2中表達(dá)沉默，DNA甲基化是其表達(dá)沉默的機(jī)制之一，去甲基化制劑5-Aza-CdR可以逆轉(zhuǎn)并恢復(fù)基因的重新表達(dá)。 （2）5-Aza-CdR及5-FU對(duì)Caco-2細(xì)胞株生長(zhǎng)速度均有較明顯的抑制作用。 （3）5-Aza-CdR聯(lián)合5-FU誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡的作用優(yōu)于兩者單純相加，具有協(xié)同作用。其中聯(lián)合用藥組可觀察到細(xì)胞凋亡所特有的典型形態(tài)學(xué)特征。 （4）5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有時(shí)效性；5-Aza-CdR