奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因?qū)τ诮Y(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖、侵襲作用的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　近年來(lái)研究表明在大量腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中往往有原癌基因c-met過(guò)表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物c-Met蛋白與結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲能力也密切相關(guān)。而NK4可阻斷由c-Met受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，將為腫瘤治療提供一種很好的策略。此外，已知化療藥物大都可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞的凋亡逃逸不但對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用，也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受的重要途徑。而c

2、-Met受體活化可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　基于以上分析，我們提出這樣一種設(shè)想：利用將NK4基因腫瘤轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞，可表達(dá)NK4通過(guò)抑制c-Met受體，除了直接發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，還可促進(jìn)凋亡，這與化療藥物的促凋亡作用相協(xié)同，可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度。為此，本研究構(gòu)建含有NK4基因的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)直腸細(xì)胞株HCT116細(xì)胞，并與化療藥物奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用。觀察奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因

3、對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、侵襲作用、凋亡的影響。
　　方法：
　　1．以原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-NK4為模板,CTS712-F/CTS712-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物及真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1質(zhì)粒KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切后電泳，切膠回收。將回收的CTS712V和CTS712I片段連接，熱轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109。涂布平板過(guò)夜培養(yǎng)菌體，挑選菌落，提取質(zhì)粒。將CTS712-1質(zhì)粒、CTS7

4、12-2質(zhì)粒用KpnⅠ/BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，基因測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。
　　2.．制作E.coli感受態(tài)細(xì)胞DH5a，將pcDNA3.1-NK4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a中。涂平板，過(guò)夜培養(yǎng)菌體，挑選菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并純化。
　　3．將pcDNA3.1-NK4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸癌HCT116細(xì)胞中。提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行鑒定。
　　4．CKK-8法檢測(cè)NK4基因?qū)CT116細(xì)胞的增殖的影響

5、；Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力的改變，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　5．奧沙利鉑處理HCT116細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察奧沙利鉑在不同濃度下細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　6．CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的OD值，分析在不同奧沙利鉑藥物濃度下對(duì)HCT116細(xì)胞毒性的影響以及奧沙利鉑最低藥物濃度與NK4基因?qū)CT116細(xì)胞增值的影響；AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀

6、檢測(cè)奧沙利鉑/NK4對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響。
　　7．利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)觀察奧沙利鉑/NK4對(duì)HCT116細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1．經(jīng)鑒定CTS712-1質(zhì)粒即是我們需要的pcDNA3.1-NK4質(zhì)粒。
　　2．大腸癌HCT116細(xì)胞的NK4基因PCR擴(kuò)增后，空白組的2-ΔΔCt為100％，pcDNA3.1陰性對(duì)照組的2-ΔΔCt為446.40%，

7、pcDNA3.1-NK4處理組的2-ΔΔCt為725313%。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4后，抑制了細(xì)胞的增殖；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染后侵襲率降為原先的50%左右；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率提高了約12%。
　　3．大腸癌HCT116細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞延展，呈不規(guī)則形狀，排列緊密。奧沙利鉑溶液處理細(xì)胞6小時(shí)后，細(xì)胞變圓，被膜突起，間隙增大，有細(xì)胞碎片出現(xiàn)。當(dāng)奧沙

8、利鉑溶液濃度為12.5μl/ml時(shí)，細(xì)胞發(fā)生凋亡，切隨著濃度的增高，凋亡現(xiàn)象越明顯。
　　4．CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞OD值隨著奧沙利鉑藥物濃度的增加而逐漸減??；在奧沙利鉑藥物濃度為6.3μg/ml時(shí)，細(xì)胞OD值與對(duì)照組相比有一定的下降，但不顯著。當(dāng)藥物濃度為12.5μg/ml時(shí)，細(xì)胞OD值明顯小于細(xì)胞OD值的OD值，有顯著的差異。
　　5．CCK-8檢測(cè)奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因?qū)CT116細(xì)胞增值的影響，結(jié)果顯示奧沙利

9、鉑/NK4處理組的OD值最小。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，奧沙利鉑/NK4與陰性對(duì)照組、奧沙利鉑處理組和空白組比較，差異顯著，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6．流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因作用HCT116細(xì)胞后，凋亡率提高一倍。
　　7．奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因作用下，細(xì)胞HCT116的遷移和侵襲能力分別降為89.3%，58.7%。
　　結(jié)論：
　　1．本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4質(zhì)粒，并可在大

10、腸桿菌DH5a中進(jìn)行NK4的擴(kuò)增與克隆。
　　2．將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4基因轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞的侵襲能力降低；NK4基因可以抑制HCT116細(xì)胞的增殖、侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　3．奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因作用HCT116細(xì)胞后，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡；抑制細(xì)胞的增殖，也抑制其侵襲遷移能力。
　　4．NK4基因轉(zhuǎn)移除直接發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，還可促進(jìn)凋亡，這與奧沙利