慢病毒介導(dǎo)WWOX基因過表達(dá)對Jurkat及K562白血病細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.構(gòu)建WWOX基因過表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒載體并完成相關(guān)鑒定；2.研究上調(diào)WWOX基因?qū)θ薐urkat及K562白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；3.初步探討其生物學(xué)特性改變的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：1.通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因WWOX全長cDNA片段，純化后經(jīng)Age I酶切消化。同時用Age I酶對載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切、回收得到線性化載體片段。經(jīng)T4噬菌體DNA連接酶作用將WWOX連接至線性化載體，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、挑取克隆、

2、擴(kuò)增培養(yǎng)后，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，酶切后PCR凝膠電泳鑒定連接產(chǎn)物，并行序列測定。將構(gòu)建好的融合基因表達(dá)載體進(jìn)行病毒顆粒包裝，得到WWOX過表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒載體系統(tǒng)（pGC-FU-WWOX-GFP和pGC-FU-GFP）。采用qPCR、Western blot等方法對重組載體進(jìn)行鑒定。2.采用CCK-8比色、集落形成實(shí)驗(yàn)、DAPI染色、DNA片段電泳、Annexin VPE/7-AAD雙熒光標(biāo)記、Western blot等方法

3、，研究上調(diào)WWOX對Jurkat和K562細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。3.間接免疫熒光檢測凋亡相關(guān)蛋白p53、p73、NF-κBp65及細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyto C）等的表達(dá)及定位。qPCR、Western blot檢測Bcl-2、Bax、Cyto C、Caspase-9、Caspase-3、p53、p73及NF-κB p65等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。免疫共沉淀、Western blot檢測WWOX與p73、p53之間的

4、相互作用。
　　結(jié)果：1.測序鑒定結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致，包裝后的慢病毒經(jīng)qPCR測定滴度約為2×108TU/ml。2.WWOX重組慢病毒質(zhì)粒感染Jurkat及K562細(xì)胞48h后，觀察到GFP穩(wěn)定表達(dá)。qPCR顯示pGC-FU-WWOX組細(xì)胞WWOX在mRNA水平表達(dá)增加。Western blot檢測到約72kD的融合蛋白（WWOX融合GFP）表達(dá)，隨時間延長，融合蛋白表達(dá)呈增加趨勢。CCK-8比色實(shí)驗(yàn)顯示，Jurkat和K56

5、2細(xì)胞中pGC-FU-WWOX組的細(xì)胞生長較兩對照組明顯受抑制（P＜0.05）。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，Jurkat和K562細(xì)胞中pGC-FU-WWOX組細(xì)胞集落形成率較兩對照組顯著降低（P=0.000）。DAPI染色顯示，Jurkat和 K562細(xì)胞中pGC-FU-WWOX組細(xì)胞核呈現(xiàn)Ⅱb晚期凋亡形態(tài)。DNA片段電泳顯示，Jurkat和K562細(xì)胞中pGC-FU-WWOX組出現(xiàn)明顯的梯狀降解條帶，并隨時間延長梯狀條帶生成更加明顯。Anne

6、xin VPE/7-AAD雙熒光染FCM檢測顯示，Jurkat和K562 pGC-FU-WWOX組細(xì)胞48h、72h、96h的凋亡率明顯高于其他兩對照組（P＜0.001），主要為凋亡中、晚期細(xì)胞。3.間接免疫熒光染色可見，Jurkat和K562細(xì)胞中pGC-FU-WWOX組細(xì)胞Cyto C在胞質(zhì)中呈彌散或粗塊狀分布，而p53、p73及NF-κB p65均定位于胞質(zhì)，較對照組表達(dá)差異不明顯。qPCR及Western blot顯示，Jurk

7、at和K562細(xì)胞中pGC-FU-WWOX組較其他兩對照組Bcl-2表達(dá)呈下降趨勢，Cyto C表達(dá)增加，同時兩細(xì)胞均有Caspase-9和Caspase-3的剪接激活，而p53表達(dá)變化不明顯。K562細(xì)胞中Bax表達(dá)呈上升趨勢。免疫共沉淀后SDS-PAGE電泳染色顯示，Jurkat和K562細(xì)胞pGC-FU-WWOX組均于約73～74kD處出現(xiàn)濃染的蛋白條帶，而其他兩對照組蛋白條帶染色為陰性。蛋白印跡在兩種細(xì)胞的pGC-FU-WWOX

8、組均檢測到p73及WWOX的表達(dá)，而未檢測到p53蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：1.成功構(gòu)建WWOX基因慢病毒重組載體。2.WWOX過表達(dá)可明顯抑制Jurkat和K562細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3.WWOX過表達(dá)均可使Jurkat和K562白血病細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Cyto C表達(dá)增多，同時均可激活Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)剪接，推測通過激活內(nèi)源性線粒體途徑可能是WWOX抑癌機(jī)制之一。4.Jurkat和K562白