Notch1對慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562的影響.pdf

1、研究背景 慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）是一種起源于多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，在我國其發(fā)病率占成人新診斷白血病的20％以上，年發(fā)病率為10萬分之1。常見的臨床表現(xiàn)為乏力、體重減輕、出汗、腹部異常包塊形成、脾臟腫大等。目前的治療方法主要以干擾素、骨髓移植、酪氨酸激酶抑制劑為主，但存在費(fèi)用昂貴、骨髓來源受限、療效不理想、耐藥性等問題。CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)是9號染色體與22號染色體易位形成了一個新的bcr/abl融合基因,并編碼一種

2、新的融合蛋白BCR/ABL。該蛋白具有異常增高的酪氨酸激酶活性，影響細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)和粘附分子的功能，干擾細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生。因此研究BCR/ABL融合蛋白及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對探索CML及其治療具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。 Notch基因發(fā)現(xiàn)于1916年，其突變可造成果蠅的殘翅，20世紀(jì)80年代中期Artavanis Tsakonas研究組首次克隆了該基因。Notch基因編碼的單鏈跨

3、膜受體蛋白分子量約300 kD，由2753個氨基酸殘基組成。研究發(fā)現(xiàn)，Notch從無脊椎動物到脊椎動物的多個物種中均表達(dá)，其家族成員的結(jié)構(gòu)具有高度保守性，在細(xì)胞分化、發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。Notch信號介入多種細(xì)胞的凋亡、增殖、和細(xì)胞分化多效性作用，調(diào)節(jié)多細(xì)胞動物的形態(tài)發(fā)育和形成。Notch信號的病理生理變化與腫瘤發(fā)生有關(guān)。研究表明，Notch信號途徑可以影響慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞的分化及發(fā)育，故研究P210Bcr/Abl蛋白

4、所活化的信號通路與Notch信號途徑之間的聯(lián)系，對于進(jìn)一步研究慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制，探索慢性粒細(xì)胞白血病及其新的治療靶點(diǎn)有重要意義。 目的 構(gòu)建真核表達(dá)載體myc-RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP，通過向慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP、myc-RAMIC-IRES2-EGFP、myc-RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP，進(jìn)一步探討Notch1基因?qū)562細(xì)胞生長、

5、增殖的影響。 方法 由本科室保存質(zhì)粒酶切得到RBPJ（R218H）基因片段，將RBPJ（R218H）基因插入載體PCMV-myc中，獲得融合基因myc-RBPJ（R218H）；將myc-RBPJ（R218H）插入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP，構(gòu)建真核表達(dá)載體myc-RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP；利用陽離子脂質(zhì)體LipofectinamineTM2000介導(dǎo)，將構(gòu)建質(zhì)粒myc- RBPJ（R218H）

6、-IRES2-EGFP瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，應(yīng)用Western blot 與流式細(xì)胞術(shù)檢測融合蛋白與綠色熒光蛋白的表達(dá)；采用電穿孔法將質(zhì)粒pIRES2-EGFP、myc-RAMIC-IRES2-EGFP、myc-RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP導(dǎo)入K562細(xì)胞，應(yīng)用穩(wěn)定G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，Western blot檢測myc-RAMIC 、myc-RBPJ（R218H）和EGFP在K562細(xì)胞的表達(dá)情況；從獲得的穩(wěn)定

7、轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞中提取總RNA，根據(jù)GenBank中人HES1、HES5基因的堿基序列，按照引物設(shè)計原則，針對HES1、HES5基因設(shè)計引物，經(jīng)RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞HES1、HES5表達(dá)情況，以評價Notch信號途徑活化狀態(tài)；應(yīng)用MTT法、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)研究Notch1基因?qū)562細(xì)胞生長和增殖的作用。 結(jié)果 1、成功構(gòu)建表達(dá)載體PCMV-myc-RBPJ（R218H），DNA序列分析表明myc-RB

8、PJ（R218H）融合基因開放性讀框正確，與預(yù)期設(shè)計相同； 2、成功構(gòu)建真核表達(dá)載體myc-RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP，酶切質(zhì)粒DNA鑒定正確，與預(yù)期設(shè)計一致； 3、瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot證實(shí)目的蛋白myc-RBPJ（R218H）和myc-RAMIC均能在HEK293細(xì)胞正確表達(dá)，同時伴有EGFP表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測證實(shí)轉(zhuǎn)染取得了良好的效率； 4、電穿孔法介導(dǎo)K

9、562 細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP 、myc-RAMIC-IRES2-EGFP、myc-RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP，應(yīng)用G418成功篩選建立了穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞，應(yīng)用Western blot鑒定證實(shí)目的蛋白myc-RBPJ（R218H）和myc-RAMIC均在K562穩(wěn)定表達(dá)； 5、RT-PCR檢測到轉(zhuǎn)染質(zhì)粒myc-RAMIC-IRES2-EGFP的K562細(xì)胞Notch下游靶基因HES1表達(dá)，證實(shí)

10、K562細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的myc-RAMIC有效活化了Notch信號途徑； 6、MTT法、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Notch1蛋白顯著抑制K562細(xì)胞的生長增殖能力。 結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體myc-RBPJ（R218H）-IRES2-EGFP，并鑒定能夠在HEK293 細(xì)胞中正確表達(dá)；通過電穿孔法將質(zhì)粒pIRES2-EGFP、myc-RAMIC- IRES2-EGFP、myc-RBPJ（R218H）-IRE