CASK過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及其對H1299細(xì)胞生物學(xué)功能特性的影響.pdf

1、目的：
　　肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80％-85％，是臨床最常見的一種類型。由于肺癌在早期缺乏明顯的特異性癥狀，同時易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，因此大多數(shù)患者在確診時已進(jìn)入中晚期階段，治療效果及預(yù)后均不佳。本課題組在前期通過生物信息學(xué)方法篩選出11個基因，其中人鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-depen

2、dent serine protein kinase，CASK)在報道中與肺癌發(fā)病有重要關(guān)系。故本研究通過構(gòu)建能高效表達(dá)人CASK基因的慢病毒載體并對H1299細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后進(jìn)行鑒定，并通過對人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞株進(jìn)行感染后，研究CASK過表達(dá)對其增殖能力和遷移能力的影響。
　　方法：
　　1.CASK過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建
　　采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增CASK基因片段，通過重組反應(yīng)完成目的基因擴增產(chǎn)物

3、和線性化GV358載體的體外環(huán)化。對重組產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，并對陽性克隆進(jìn)行測序分析。最后將正確克隆菌液擴大培養(yǎng)、抽提以獲得高純度質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞蛋白表達(dá)水平;用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法進(jìn)行滴度檢測。
　　2.細(xì)胞模型效能檢測將成功包裝的CASK過表達(dá)慢病毒LV-CASK（OE組）和陰性對照病毒CON238(NC組)分別感染

4、人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞，同時設(shè)置空白對照組（MOCK組），用熒光定量PCR(FQ-PCR)和Western Blot法檢測CASK表達(dá)水平。
　　3.CASK過表達(dá)對H1299細(xì)胞生物學(xué)功能特性的影響實驗分組:空白對照組（MOCK組）、CASK過表達(dá)組（OE組）和陰性對照組(NC組)，NC組和OE組分別用CON238和LV-CASK進(jìn)行感染，MOCK組不予任何處理，分別使用MTT法和細(xì)胞劃痕實驗觀察CASK過表達(dá)對H1299

5、細(xì)胞增殖能力和遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.CASK過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建
　　通過PCR技術(shù)成功地擴增CASK基因片段并連接到GV358病毒載體上，PCR及DNA測序鑒定結(jié)果證明CASK-GV358質(zhì)粒構(gòu)建正確。重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可觀察到綠色熒光及蛋白表達(dá)，包裝過表達(dá)慢病毒并測定其濃縮滴度為2×108 TU/mL。
　　2.細(xì)胞模型效能檢測
　　FQ-PCR和Western Blot檢測

6、結(jié)果顯示，與NC組相比，OE組CASKmRNA和蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05)。
　　3.CASK過表達(dá)對H1299細(xì)胞生物學(xué)功能特性的影響
　　MTT法結(jié)果表明，OE組細(xì)胞增殖能力與NC組相比有明顯差異(P＜0.05)，提示CASK過表達(dá)對H1299細(xì)胞增殖能力有抑制作用;細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明OE組細(xì)胞遷移能力與NC組無明顯差異(P＞0.05)，CASK過表達(dá)對H1299細(xì)胞遷移能力無明顯作用。
　　結(jié)論：