microRNA-199a慢病毒載體的構(gòu)建及其對激素非依賴前列腺癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的作用研究.pdf

1、一、研究背景及目的
　　 前列腺癌(prostate cancer)是中、老年男性常見的泌尿系惡性腫瘤。其發(fā)病率和病死率分別居全球男性癌癥發(fā)病率的第二位和第六位。在美國，前列腺癌的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤之首，居40歲以上男性癌癥死因次席。目前中國等亞洲國家前列腺癌發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于歐美等發(fā)達(dá)地區(qū)，但隨著中國社會老齡化程度的加劇、腫瘤檢測手段的提高及飲食、生活習(xí)慣、居住環(huán)境的改變，發(fā)病率呈明顯增長趨勢。因此，前列腺癌越來越受到人們的關(guān)

2、注。其發(fā)生、發(fā)展、惡化機(jī)制和治療手段研究已經(jīng)成為泌尿外科的熱點(diǎn)研究之一。
　　 前列腺癌(PCa)早期無相關(guān)臨床癥狀，雖然目前血清前列腺特異性抗原(PSA)等篩查手段的應(yīng)用，其檢出率明顯提高，但仍存在相當(dāng)比例患者在確診前列腺癌時處于疾病進(jìn)展期:高血清PSA值，高Gleason評分、且發(fā)生局部或遠(yuǎn)處骨轉(zhuǎn)移，從而失去根治性前列腺切除的機(jī)會而選擇內(nèi)分泌治療。去勢治療對雄激素依賴型前列腺癌療效確切，包括手術(shù)和藥物去勢兩種方法，均可促使腫

3、瘤細(xì)胞逐漸凋亡并降低患者PSA水平，緩解疼痛等癥狀，有效延緩腫瘤的惡化及轉(zhuǎn)移。但內(nèi)分泌治療即最大雄激素阻斷(MAB)的有效時間較短，其中位有效時間僅為14-30月，后期幾乎所有患者都將發(fā)展為雄激素非依賴前列腺癌(AIPC)。對泌尿外科醫(yī)師而言，發(fā)展為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的患者對內(nèi)分泌治療及化療均不敏感且疾病惡化迅速，是無法治愈的階段，患者中位生存時間僅18～20月。研究表明前列腺癌進(jìn)展與雄激素受體及相關(guān)信號通路的改變密切相

4、關(guān)，但激素依賴性前列腺癌如何轉(zhuǎn)變?yōu)榧に胤且蕾囆郧傲邢侔┑臋C(jī)制尚不清楚。因此，研究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、惡化、轉(zhuǎn)移中雄激素受體及信號通路的作用以及受體相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，極大有助于了解前列腺癌從激素依賴轉(zhuǎn)變激素抵抗的分子機(jī)制。
　　 Micro-RNA是內(nèi)源性非編碼RNA分子，由長約18～25個單鏈核苷酸組成。研究表明，眾多Micro-RNA不僅在多肽鏈的合成中發(fā)揮作用，而且能有效調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡和代謝等過程起

5、著重要調(diào)節(jié)作用，其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控是近年來醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域研究的熱門，提示生物體內(nèi)存在著由RNA介導(dǎo)的遺傳信息表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一個Micro-RNA可以調(diào)控多個靶基因，而一個靶基因又可同時被多個Micro-RNA所調(diào)控，不同類型的腫瘤以及腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、惡化中的不同階段，都有自己獨(dú)特的Micro-RNA異常表達(dá)譜.一般認(rèn)為在動物細(xì)胞中，Micro-RNA主要通過不完全互補(bǔ)的方式與編碼蛋白mRNA的堿基配對結(jié)合，引起目標(biāo)靶mRN

6、A的失活、降解或翻譯受阻，從而在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行對基因的調(diào)控。
　　 研究認(rèn)為，microRNA-199a(縮寫為miR-199a)在諸多人類惡性腫瘤中起抑制腫瘤細(xì)胞生長的調(diào)控作用，如乳腺癌、大腸癌、骨肉瘤等等，但是有關(guān)miR-199a對前列腺癌細(xì)胞的作用及相關(guān)調(diào)控機(jī)制至今未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。鑒于慢病毒載體系統(tǒng)能高效、穩(wěn)定地將目的基因?qū)氩溉閯游锏脑蚰[瘤細(xì)胞系且可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定的表達(dá)，受免疫、內(nèi)環(huán)境等影響小，安全性較高。我們擬

7、通過基因芯片檢測及臨床腫瘤標(biāo)本及癌旁組織驗(yàn)證miR-199a在前列腺癌組織及周圍正常前列腺組織的差異表達(dá)，并通過構(gòu)建miR-199a慢病毒過表達(dá)載體研究miR-199a表達(dá)水平的變化對前列腺癌激素非依賴細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的影響，為后續(xù)針對miR-199a進(jìn)行前列腺癌的分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　 二、研究方法、結(jié)果
　　 （一）microRNA-199a慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建及其效率驗(yàn)證
　　 慢病毒載體系統(tǒng)能穩(wěn)

8、定、高效地將目的基因?qū)氩溉閯游锏脑蚰[瘤細(xì)胞系，且可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定的表達(dá)，受免疫、內(nèi)環(huán)境等影響小，安全性較高等優(yōu)點(diǎn)。因此我們選擇慢病毒載體體系構(gòu)建pCDH-miR-199a載體。首先根據(jù)文獻(xiàn)報道及Genebank查詢的相關(guān)基因序列，合成特異性引物（帶酶切位點(diǎn)），real-time PCR技術(shù)對目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，RT-PCR產(chǎn)物雙酶切及載體酶切后連接到pCDH體系中，經(jīng)過陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、慢病毒的獲得、濃縮及滴度測定，通

9、過熒光顯微鏡成像得出我們構(gòu)建的pCDH-miR-199a慢病毒獲得較高的濃度滴度。慢病毒感染前列腺癌激素非依賴DU-145細(xì)胞后，經(jīng)PCR檢測，結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的pCDH-miR-199a載體能顯著上調(diào)miRNA-199a在DU-145細(xì)胞中表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)進(jìn)行miRNA-199a表達(dá)水平的變化對DU-145細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　 （二）microRNA-199a在臨床前列腺癌(PCa)組織中低表達(dá)(

10、16對腫瘤與癌旁組織)
　　 首先利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-199a在臨床前列腺癌標(biāo)本組織與癌旁正常的前列腺組織之間存在有統(tǒng)計學(xué)意義的表達(dá)差異。取經(jīng)手術(shù)切除的前列腺癌和癌旁正常組織各16例，腫瘤組織的定位根據(jù)術(shù)前磁共振(MRI)等影像學(xué)檢查、術(shù)前穿刺病理報告腫瘤陽性位點(diǎn)、前列腺切除組織的硬度觸摸等手段來大體明確。術(shù)后病理切片染色明確所取標(biāo)本組織包括前列腺癌和周圍正常前列腺組織。所取的標(biāo)本分別置入液氮中凍存和中性福爾馬林溶液中固

11、定。上述凍存及固定標(biāo)本經(jīng)RNA抽提、Poly(A)加尾和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16對術(shù)后病理診斷明確為前列腺癌與周圍正常癌旁前列腺組織的miR-199a表達(dá)水平存在顯著差異，與正常癌旁組織比較，腫瘤組織miR-199a的表達(dá)水平顯著下降(P=0.07)。通過上述結(jié)果表明，miR-199a極有可能參與調(diào)控了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及向激素非依賴轉(zhuǎn)變等病理過程。
　　 （三）miR-199a高表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞DU-14

12、5增殖、遷移、克隆形成及細(xì)胞周期與凋亡的影響。
　　 第三部分實(shí)驗(yàn)中，我們通過慢病毒載體介導(dǎo)miR-199a高表達(dá)，以研究miR-199a對前列腺癌激素非依賴細(xì)胞生物學(xué)特性方面的影響。我們選擇DU-145細(xì)胞株為研究對象，通過慢病毒載體有效感染前列腺癌DU-145細(xì)胞，病毒感染后第五天在倒置熒光鏡下觀察得出慢病毒感染DU-145細(xì)胞效率高。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測DU-145細(xì)胞生長狀況，與空白和陰性對照組相比，miRNA-199a

13、高表達(dá)后的DU-145細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，酶標(biāo)儀595nm檢測的OD值降低。
　　 我們設(shè)計了Transwell實(shí)驗(yàn)研究miRNA-199a高表達(dá)后對雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞DU-145遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miRNA-199a明顯抑制前列腺癌DU-145細(xì)胞的遷移能力。腫瘤的克隆形成能力方面，我們通過DU-145細(xì)胞在平板上的克隆形成能力來反應(yīng)并衡量腫瘤細(xì)胞的成瘤能力。我們發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒載體介導(dǎo)miRNA

14、-199a高表達(dá)后，DU-145細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低，表現(xiàn)為與con、Lv-shcon組相比，Lv-shmiRNA-199a組克隆的數(shù)目少，克隆的體積小，且克隆分散，成團(tuán)能力差。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miRNA-199a明顯抑制前列下癌DU-145細(xì)胞的克隆形成能力，具體表現(xiàn)為克隆體積小、分散，且成團(tuán)能力差。為進(jìn)一步探討miRNA-199a高表達(dá)后對前列腺癌DU-145細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響，我們利用PI染色流式細(xì)胞技術(shù)來檢

15、測細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡比例，根據(jù)細(xì)胞周期各階段所含DNA的不同，來測定細(xì)胞的周期分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表明miRNA-199a高表達(dá)后能夠?qū)е翫U-145細(xì)胞出現(xiàn)G1/S期阻滯。此外，miRNA-199a高表達(dá)后能夠促進(jìn)DU-145細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　 三、結(jié)論
　　 綜合以上三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為:從芯片檢測及臨床組織標(biāo)本驗(yàn)證miRNA-199a在前列腺癌中顯著低表達(dá)，慢病毒載體能夠高效、穩(wěn)定的上調(diào)目標(biāo)靶分子miRNA-1