前列腺癌非激素依賴轉(zhuǎn)化中磷酸化蛋白差異及其作用途徑研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文前列腺癌非激素依賴轉(zhuǎn)化中磷酸化蛋白差異及其作用途徑研究姓名：王輝清申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)（泌尿外科學(xué)）指導(dǎo)教師：孫穎浩20090501第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 中文摘要析( i m m o b i l i z e d m e t a l a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y , I M A C ) 富集兩種細胞的磷酸化蛋白，并分離純化，利用二維凝膠電泳技術(shù)分

2、離兩種細胞磷酸化蛋白質(zhì)組樣品，獲得滿意的兩種細胞株的磷酸化蛋白雙向凝膠電泳圖譜，凝膠經(jīng)銀染顯色后，P S Q u e s t 分析軟件進行比較分析，篩選出差異3 倍以上的且超過半數(shù)膠中均存在的蛋白點。將差異點從膠中切出，進行膠內(nèi)酶解，得到肽段混合物。應(yīng)用基質(zhì)輔助的激光解吸飛行時間質(zhì)譜( M A L D I ．T O F ．M S ) 與串聯(lián)質(zhì)譜( M S ／M S ) 方法對差異點進行磷酸化蛋白質(zhì)鑒定。使用M a s c o t 查詢軟

3、件搜索S W I S S ．P R O T 以及N C B I n r 數(shù)據(jù)庫做生物信息學(xué)分析。( 三) 、從2 ．D E 篩選出的差異磷酸化蛋白中挑選T P e r o x i r e d o x i n ．2 和H S P 2 7 兩種蛋白，應(yīng)用w e g e m b l o t 的方法進行驗證。( 四) 、運用S T R I N G 數(shù)據(jù)庫和軟件對L N C a P - A I 中所有的、上調(diào)的、下調(diào)的鑒定的磷酸化蛋白質(zhì)進行一級相

4、互作用預(yù)測，探討其在信號通路中的作用。四、結(jié)果( 一) 、L N C a P 前列腺癌細胞在去激素的環(huán)境下生長迅速受到抑制，一周左右開始處于自分泌狀態(tài)，1 個月后逐漸適應(yīng)了去雄激素的環(huán)境，6 個月后能夠正常增殖和傳代，成為激素非依賴的L N C a P ．A I 細胞亞系，其P S A 分泌水平隨雄激素水平的增高而增加，但表達P S A 的水平要低于L N C a P 細胞。( - - ) 、采用磷酸化富集及二維凝膠電泳分離L N C

5、a P 細胞和L N C a P ．A I 細胞磷酸化蛋白質(zhì)組樣品，凝膠經(jīng)銀染顯色后，P D Q u e s t 7 ．1 ．0 軟件進行比較分析。共發(fā)現(xiàn)2 8 個點差異在3 倍以上，其中有1 3 個點在L N C a P ．A I 細胞組表達上調(diào)，1 5 個點在L N C a P 細胞對照組表達上調(diào)。( - - - ) 、應(yīng)用M A L D I - T O F - M S 質(zhì)譜技術(shù)( V o y a g e r - D ES T R

6、質(zhì)譜儀，美國A p p l i e dB i o s y s t e m s 公司) 對差異蛋白質(zhì)點進行鑒定，用M a s c o t 數(shù)據(jù)庫。共鑒定出包括核磷蛋白( N u c l e o p h o s m i n ) 、熱休克蛋I 蘭t 1 3 1 ( H e a t s h o c k p r o t e i nb e t a - I ．H S P 2 7 ) 、過氧化物還原酶2 和6 ( P e r o x i r e d o

7、 x i n ．2 和P e m x i r e d o x i n - 6 ) 等參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架調(diào)節(jié)、能量代謝等有關(guān)的1 7 種蛋白質(zhì)。( 四) 、應(yīng)用W e s t e r n - b l o t 的方法對包括P e r o x i r e d o x i n ．2 ，H e a ts h o c kp r o t e i nb e t a —l 在內(nèi)的2 種蛋白進行了驗證，蛋白變化趨勢與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。( 五) 、應(yīng)用S