GPC3過表達對肝癌Huh-7細胞生物學(xué)功能影響的研究.pdf

1、[目的]
　　 GPC3是一種膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在肝癌組織中有特異性的高表達。目前大多數(shù)學(xué)者主要通過抑制GPC3在肝癌細胞中的表達，檢測肝細胞癌的生物學(xué)行為改變明顯受到抑制，從而認(rèn)為GPC3是作為一種促癌基因?qū)Ω伟┘毎鹱饔?。但是在間皮瘤、卵巢癌細胞系、乳腺癌和肺癌中發(fā)現(xiàn)GPC3是由于其啟動子的過甲基化而造成蛋白表達缺失，提示GPC3可能發(fā)揮抑癌基因作用，而且在肝癌的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。本課題選擇高表達GPC3基因的h

2、uh-7細胞，通過上調(diào)GPC3的表達后檢測huh-7細胞的生物學(xué)功能的變化，旨在進一步研究GPC3在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　 [方法]
　　 1、通過脂質(zhì)體法將GPC3基因過表達真核表達質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染至Huh-7細胞。
　　 2、應(yīng)用熒光定量PCR和Western Blot檢測GPC3mRNA和蛋白的表達，驗證GPC3基因過表達。
　　 3、采用Annexin V-FITC/PI雙染經(jīng)流式細胞儀檢測

3、細胞周期和細胞凋亡。
　　 4、利用EDU檢測細胞增殖。
　　 5、運用Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力。
　　 [結(jié)果]
　　 1、構(gòu)建基因GPC3 CDS克隆入真核表達載體pcDNA3.1+中的GPC3測序F為5'GATTCAGCCTTGGACATCAATG3'，與原始序列完全一致，表明已成功構(gòu)建GPC3真核表達載體pcDNA3.1+，可以用于后續(xù)過表達實驗。
　　 2、GPC3真核

4、表達載體pcDNA3.1+瞬時轉(zhuǎn)染Huh-7細胞72h后熒光定量PCR和Western Blot檢測顯示GPC3mRNA和蛋白表達都明顯高于對照組，表明成功上調(diào)Huh-7細胞的GPC3表達水平，可進行后續(xù)的細胞生物學(xué)行為研究實驗。
　　 3、在過表達Huh-7細胞組、Huh-7細胞組和NC組中，在G1期的細胞數(shù)分別為(49.77±2.08)％、（49.28±1.0）％和（50.29±1.52）％(P＞0.05);在G2期的細胞數(shù)

5、分別為（7.92±1.0）％、(11.89±2.0)％和(12.49±0.58)％(P＜0.05);S期所占的細胞數(shù)分別為(42.31±3.06)％、(38.83±1.73)％和（37.22±2.0）％(P＜0.05);表明過表達GPC3將Huh-7細胞分裂周期阻滯在S期。
　　 4、在過表達Huh-7細胞組、Huh-7細胞組和NC組中，細胞凋亡率分別為（23.71±0.01）％、（9.4±0.02）％和（9.19±0.01）％

6、(P＜0.01);表明過表達GPC3后能夠明顯誘導(dǎo)Huh-7細胞的凋亡。
　　 5、在過表達Huh-7細胞組、Huh-7細胞組和NC組中，瞬時轉(zhuǎn)染GPC3過表達質(zhì)粒48小時后，細胞增值率分別為（87.06±1.58）％、（90.12±1.93）％和（91.02±0.35）％（P＜0.05），提示GPC3過表達后可使Huh-7細胞的增殖降低。
　　 6、在過表達Huh-7細胞組、Huh-7細胞組和NC組中，細胞遷移率分別為

7、(14.03±0.92)％、（54.60±1.01）％和（32.87±0.29）％（P＜0.01），這說明過表達GPC3能夠抑制Huh-7細胞的遷移。
　　 7、在過表達Huh-7細胞組、Huh-7細胞組和NC組中，細胞侵襲分別為（4.93±0.38）％、（7.13±0.83）％和(10.53±0.06％)(P＜0.05)，表明過表達GPC3后Huh-7細胞的侵襲能力明顯受到抑制。
　　 [結(jié)論]
　　 將過表達