鞘氨醇激酶1對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：近年來研究表明鞘脂代謝產(chǎn)物是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它們參與腫瘤浸潤(rùn)、增殖及血管生成的調(diào)節(jié)，其中神經(jīng)酰胺（Ceramide Cer）及鞘氨醇(Sphingosine SP)和1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phospate S1P)的動(dòng)態(tài)平衡決定腫瘤細(xì)胞的凋亡和存活，三者之間的平衡受多種酶的嚴(yán)格調(diào)控，鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinasel，SPK1)的作用最為關(guān)鍵，其催化SP形成S1P,不僅增加促進(jìn)生長(zhǎng)、抑

2、制凋亡的信使S1P，還能減少有促進(jìn)凋亡作用的Cer、SP。本課題研究利用攜帶目的基因的重組腺病毒感染肝癌耐藥細(xì)胞株BEL-FU后對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡、侵襲能力、耐藥特性的影響。
　　 方法：病毒包裝細(xì)胞AD293細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100u/L青霉素、100μ/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，擴(kuò)增并純化攜帶野生型SPK1基因(Ad-SPK

3、1WT)和干涉型SPK1基因(Ad-H1-SPK1)的重組腺病毒，以TCID50方法（IU/ml）和快速CPE法(IU/ml)測(cè)定腺病毒感染滴度。人肝癌耐藥細(xì)胞株BEL-FU培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100u/L青霉素、100μ/L鏈霉素、20000ng/L5-FU的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，以0.25％胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將干涉型SPK1基因(Ad-H1-S

4、PK1)及野生型SPK1基因(Ad-SPK1WT)導(dǎo)入人肝癌耐藥細(xì)胞株BEL-FU中；用酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定SPK酶活性，MTT法檢測(cè)其對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞凋亡特性的影響，Transwell法測(cè)定其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲力的影響，western-blot方法檢測(cè)多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：⑴重組腺病毒擴(kuò)增并純化氯化銫密度梯度離心后可獲得高度濃縮的腺病毒。⑵重組腺病毒對(duì)BEL-FU感染效率的測(cè)定及SPK1基因轉(zhuǎn)移

5、以Ad-EGFP評(píng)價(jià)腺病毒對(duì)BEL-FU細(xì)胞的感染效率。當(dāng)MOI=150時(shí)可見到幾乎滿視野的熒光，且對(duì)BEL-FU無明顯毒作用。⑶SPK酶活性測(cè)定利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)孔及實(shí)驗(yàn)孔，根據(jù)數(shù)值做標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=1，感染攜帶Ad-SPK1WT基因腺病毒的BEL-FU細(xì)胞SPK活性明顯強(qiáng)于感染攜帶Ad-H1-SPK1基因的BEL-FU細(xì)胞，三者之間經(jīng)單因素方差分析P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑷鞘氨醇激酶對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞凋亡特性的影響5-25μmo

6、l/1濃度范圍的DMS(N，N，-二甲基鞘氨醇)對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用，細(xì)胞存活率隨藥物濃度升高而降低。⑸鞘氨醇激酶對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞侵襲力的影響攜帶Ad-SPK1WT基因的BEL-FU細(xì)胞的平均侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于攜帶Ad-GFP的對(duì)照組，而攜帶Ad-H1-SPK1基因的BEL-FU細(xì)胞的平均侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組，說明過表達(dá)SPK的肝癌細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)，而干涉SPK則降低肝癌細(xì)胞的侵襲力。⑹鞘氨醇激酶對(duì)MRP1表達(dá)的影響Western b

7、lot結(jié)果顯示：Ad-SPK1WT、對(duì)照組及Ad-H1-SPK1均有MRP1的表達(dá)，且攜帶Ad-SPK1WT多于對(duì)照組，而攜帶Ad-H1-SPK1則少于對(duì)照組。Ad-SPK1WT、對(duì)照組及Ad-H1-SPK1與β-actin的積分密度比值分別為0.94±0.05，0.77±0.07，0.58±0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：①能獲得高感染滴度的Ad-SPK1WT腺病毒和Ad-H1-SPK1腺病毒。②攜帶A

8、d-SPK1WT及Ad-H1-SPK1的重組腺病毒能高效感染BEI-FU細(xì)胞株。③攜帶Ad-SPK1WT的重組腺病毒感染BEL-FU細(xì)胞后增強(qiáng)細(xì)胞中SPK活性；攜帶Ad-H1-SPK1的重組腺病毒感染BEL-FU細(xì)胞后降低細(xì)胞中SPK活性。④攜帶Ad-SPK1WT的重組腺病毒感染BEL-FU細(xì)胞后降低DMS(N，N，-二甲基鞘氨醇)對(duì)肝癌細(xì)胞的促凋亡作用；而攜帶Ad-H1-SPK1的重組腺病毒感染BEL-FU細(xì)胞后增強(qiáng)DMS對(duì)肝癌細(xì)胞的