siRNA干擾Smo基因?qū)θ烁伟〩epG2細胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、肝癌是世界常見惡性腫瘤之一，其中肝細胞癌（hepatocelluar carcinoma， HCC)是最主要的類型，其特點是侵襲力強、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，它由多種基因參與，涉及多條信號通路。在我國，肝癌發(fā)病率極高，約占全世界的42.5％。自20世紀90年代以來，我國肝癌死亡率為20～40/10萬，高居癌癥死亡率的第2位，本文應(yīng)用Western blot及半定量RT-PCR技術(shù)，旨在觀察Smo基因在肝癌HepG2細胞中的表達及其對肝癌HepG

2、2細胞影響的作用。RT-PCR及Westem blot檢測肝癌HepG2細胞中Smo基因的表達；利用RNAi技術(shù)siRNA脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，MTT法和流式細胞儀檢測肝癌HepG2細胞smo mRNA被降解后對細胞的影響。探討Smo基因在肝癌細胞增殖和凋亡過程中的作用。
　　目的：探討Smo基因在肝癌細胞增殖和凋亡過程中的作用及與肝癌的關(guān)系，為Smo基因在Sonic hedgehog信號通路上能否靶向治療肝癌提供實驗

3、依據(jù)。
　　方法：⑴細胞來源：本實驗所使用的人肝癌HepG2細胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)老師贈與。主要試劑：Trizol（總RNA提取試劑異硫氰酸胍)、FSK-100(RT-PCR試劑盒)、兔抗人Smo濃縮型多克隆抗體（一抗）、Annexin-V凋亡檢測試劑盒、辣根酶標記羊抗兔IgG多聚體(二抗)、MTT等。主要設(shè)備：C02恒溫孵育箱、PCR擴增儀、流式細胞儀、轉(zhuǎn)印電印電泳槽、DYY-B型電泳儀。⑵細胞培養(yǎng):HepG2細胞在培養(yǎng)基(含1.

4、0mM丙酮酸鈉，0.1mM非必需氨基酸和1.5克/升碳酸氫鈉的EMEM，添加10%胎牛血清。)于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。⑶RT-PCR檢測肝癌HepG2細胞Smo mRNA的表達。⑷Western blot檢測HepG2細胞Smo蛋白的表達。⑸siRNA序列的設(shè)計與合成：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3，及1對非特異性siRNA。⑹細胞轉(zhuǎn)染及siRNA篩選：分成A、B、C、D、E五組：A

5、組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-1組，B組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-2組、C組為轉(zhuǎn)染特異性siRNA-3組，D組為陽性對照組(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)，E組為陰性對照組(轉(zhuǎn)染時只加Lipofectamine，不加任何siRNA)，每組設(shè)6個重復(fù)孔。⑺RNAi技術(shù)分別將Smo siRNA轉(zhuǎn)染入各組人肝癌HepG2細胞內(nèi)。⑻RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染48小時后各組細胞的Smo mRNA表達，比較3組特異組表達的效果，篩選出抑制最有效的siRNA，后繼

6、實驗中均以該特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細胞為實驗組。⑼再將HepG2細胞分成實驗組、陽性對照組、陰性對照組，每組設(shè)6個重復(fù)孔進行轉(zhuǎn)染。⑽噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。⑾統(tǒng)計學(xué)方法分析：數(shù)據(jù)采用SPSSl8．0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：①Western blot及半定量RT-PCR結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)人肝癌HepG2細胞內(nèi)有Smo蛋白及Smo mRNA的高表達。②按照分組，轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR結(jié)果顯示：si

7、RNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組及陽性對照組與陰性對照組的HepG2細胞的Smo mRNA表達水平有顯著性差異(F=382.0，P<0．001)，siRNA-1組表達水平最低，siRNA-2組次之，兩組分別與陰性對照組比較，差異均有顯著性(P<0.001)；siRNA-3組、陰性對照組與陽性對照組比較，差異無顯著(P>O．05)；siRNA-1組與siRNA-2組比較，差異亦有顯著性(P<0.001)。根據(jù)圖形計算siR

8、NA-3組無明顯抑制抑制作用，siRNA-1組、siRNA-2組的抑制率分別為65．72％、46．17％，所以后續(xù)實驗選擇siRNA-1組作為實驗組。③于轉(zhuǎn)染后的不同時間點，三組實驗細胞（siRNA-1組、陽性對照組及陰性對照組）的增值水平通過RT-PCR顯示有顯著性差異(F=4.628，P<0.001)，實驗組（siRNA-1組）細胞的增值水平在不同時間點均顯著低于陰性對照(P<0.05)。④siRNA轉(zhuǎn)染48h后，siRNA-1組、

9、陽性對照組及陰性對照組的HepG2細胞的凋亡率分別為23.5％、9.8％、3.5％，siRNA-1組細胞凋亡率較陽性對照組和陰性對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=14．813，P<0.001)
　　結(jié)論：⑴肝癌的發(fā)生與SHH信號通路中Smo基因的高表達相關(guān)；并且Smo基因的高表達影響到肝癌HepG2細胞的增殖與凋亡。⑵通過RNAi技術(shù)，應(yīng)用Smo siRNA轉(zhuǎn)染降解肝癌HepG2細胞內(nèi)的Smo mRNA實驗是可行的。⑶利用