RNA干擾GPC3基因?qū)Ω伟﹉uh-7細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),是一種嚴(yán)重影響人類健康的惡性腫瘤。我國是世界上肝癌高發(fā)區(qū)之一,發(fā)病率為20.37/10萬,位于常見腫瘤的第3位。據(jù)2002年全球最新統(tǒng)計(jì),肝癌發(fā)病率在常見癌癥中排行第6,而病死率則排第3位,每年發(fā)病人數(shù)為62.6萬例,新增5.7％,共有59.8萬例死亡,其中82％的病例在發(fā)展中國家,中國占55％。雖然目前臨床上可用于治療肝癌的手段

2、比較多,包括手術(shù)切除、肝移植、血管介入、消融技術(shù)、放化療等,且在肝癌的藥物治療上取得重大突破,但手術(shù)切除仍被公認(rèn)為肝癌獲得根治的最好手段。然而,即使是根治性切除,5年內(nèi)仍有60～70％的病人出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),而局部治療的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率更高。如何預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為提高肝癌生存率的關(guān)鍵。因此,尋找預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移傾向、判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物,探索預(yù)防和治療的有效途徑,從而降低死亡率,提高肝癌患者的5年生存率,這是肝癌研究的重點(diǎn)內(nèi)容,也是腫瘤防治研究中

3、的一個難點(diǎn)。
　　 GPC3(Glypican-3,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3,又稱MXR7、OCI-5、GTXR2-2)蛋白是硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan,HSPG)家族中的一員。GPC3的突變導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失去平衡,可能是腫瘤發(fā)生的重要因?yàn)?。GPC3還可結(jié)合肝素結(jié)合型蛋白如細(xì)胞粘附分子、基質(zhì)成分、生長因子、酶和酶抑制物,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、粘附和遷移等過程,還可能參與抑制

4、或調(diào)節(jié)大部分中胚層組織和器官生長的過程。目前研究發(fā)現(xiàn)GPC3參與Wnt、Hedgehog(Hh)、FGF、IGF、BMP、SMAD、TGF-β等多個與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路的調(diào)節(jié)。研究表明GPC3在肝細(xì)胞癌、大腸癌、惡性黑色素瘤、Wilm’s瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和肝胚細(xì)胞瘤高表達(dá),而在肺腺癌、卵巢癌、乳腺癌、間皮瘤中表達(dá)顯著下調(diào),提示GPC3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　 RNA干擾(RNA interferenc

5、e,RNAi)是將與目的基因mRNA序列互補(bǔ)的小的雙鏈RNA導(dǎo)入靶細(xì)胞,促使mRNA降解,誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,從而高效特異性阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)。其特征為:①RNAi是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA,特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA和反義RNA),從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。②RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA(d

6、sRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的mRNA降解成21nt～23nt的小片段,使相應(yīng)的基因沉默。③RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptionalgene silencing,PTGS)。④RNAi存在瀑布放大效應(yīng),每個細(xì)胞僅需幾分子siRNA就可產(chǎn)生RNAi效應(yīng),并可達(dá)到缺失突變體表型的程

7、度。相比普通siRNA,具有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA,穩(wěn)定性比siRNA更好,而且能延長目的基因沉默的時間。
　　 本研究擬應(yīng)用RNA干擾技術(shù)將靶向GPC3基因的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染肝癌離體細(xì)胞株huh-7,觀察GPC3基因表達(dá)沉默后對肝癌細(xì)胞株huh-7生物學(xué)特性的影響,初步探討GPC3基因在肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移中的作用。研究的目的在于給肝癌GPC3基因治療的可行性提供初步依據(jù)。
　　 方法
　　 設(shè)計(jì)靶向GP

8、C3基因的siRNA,瞬時轉(zhuǎn)染肝癌離體細(xì)胞huh-7,觀察GPC3基因的表達(dá)情況。
　　 1.siRNA的設(shè)計(jì) 應(yīng)用siRNA設(shè)計(jì)軟件初篩出9對siRNA,再通過BLAST分析剔除與其他編碼基因有同源性的siRNA,最后經(jīng)RNA結(jié)構(gòu)分析軟件分析將對應(yīng)的基因序列位于二級結(jié)構(gòu)的siRNA去掉,選出兩條對靶向GPC3的siRNA(包括GPC3-siRNA-1161、GPC3-siRNA-516)。
　　 2.瞬時轉(zhuǎn)染肝癌huh

9、-7細(xì)胞 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將GPC3-siRNA轉(zhuǎn)染huh-7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時后進(jìn)行相應(yīng)檢測。
　　 3.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測 用real-time PCR技術(shù)檢測干擾后huh-7細(xì)胞的GPC3表達(dá)量,然后用Western-blot檢測干擾后GPC3的蛋白表達(dá)水平,AnnexinV-FITC/PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測細(xì)胞增殖情況,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方

10、法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x(_)±s)表示。MTT細(xì)胞增殖檢測、細(xì)胞凋亡檢測及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)均采用析因設(shè)計(jì)方差分析比較各組間差異；P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.GPC3 mRNA表達(dá)的測定real-time PCR結(jié)果顯示,導(dǎo)入設(shè)計(jì)的siRNA(包括GPC3-siRNA-1161、GPC3-siRNA-516)的huh-7細(xì)胞GPC3表達(dá)水平為未轉(zhuǎn)染的hu

11、h-7細(xì)胞的0.56±0.07和0.10±0.06,P值:0.000,F值:257.640。
　　 2.GPC3蛋白的表達(dá)的測定Western blot結(jié)果顯示,GPC3-siRNA-1161組、GPC3-siRNA-516組、NC-siRNA-173組和NS組的GPC3蛋白相對表達(dá)量分別為0.51±0.06、0.15±0.05、1.08±0.04和1.03±0.01,P值:0.000,F值:314.814。
　　 3.

12、細(xì)胞凋亡率的測定 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染72小時后GPC3-siRNA-1161組的細(xì)胞凋亡率為23.13±0.39％,GPC3-siRNA-516組細(xì)胞凋亡率為24.90±0.28％,均顯著高于未轉(zhuǎn)染的huh-7組的細(xì)胞凋亡率(12.24±1.23％)(P值:0.000,F值:139.553)。然而值得注意的是,轉(zhuǎn)染后96小時后兩干擾組與未轉(zhuǎn)染組間雖然仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但差異已變小(GPC3-siRNA-1161組:28.11±0.12％,GPC

13、3-siRNA-516組:29.37±0.34％,未轉(zhuǎn)染組:25.87±1.85％；P值:0.029,F值:5.085)。
　　 4.細(xì)胞增殖的測定 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后48小時和72小時GPC3-siRNA-1161組和GPC3-siRNA-516組的活細(xì)胞數(shù)顯著低于未轉(zhuǎn)染組,以72小時最為明顯(GPC3-siRNA-1161組:0.962±0.025,GPC3-siRNA-516組:0.871±0.034,未轉(zhuǎn)染組:1.953±0

14、.043；P值:0.000,F值:819.992)。轉(zhuǎn)染96小時后,兩干擾組與未轉(zhuǎn)染組間的差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但已明顯變小(GPC3-siRNA-1161組:1.863±0.058,GPC3-siRNA-516組:1.816±0.052,未轉(zhuǎn)染組:2.842±0.013；P值:0.002,F值:294.267)。并且兩干擾組96小時的活細(xì)胞數(shù)較72小時增長超過2倍。
　　 5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測GPC3基因沉默后對肝癌細(xì)胞體外運(yùn)

15、動遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同時間點(diǎn)遷移細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(F=1594.373,P=0.000)；GPC3-siRNA-1161組和GPC3-siRNA-516組細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于NS組和NC-siRNA-173組,差異具有顯著性(F=125.549,P=0.000)；不同細(xì)胞在不同時間遷移細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(F=24.233,P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 1.通過siRNA設(shè)計(jì)軟件初篩-BLAST分析-

16、RNA結(jié)構(gòu)分析軟件分析這3步進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì),是一種快速、簡便、有效的方法。
　　 2.應(yīng)用RNAi技術(shù),將靶向GPC3基因的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞(huh-7),能成功介導(dǎo)GPC3基因沉默,達(dá)到靶向封閉GPC3基因的目的。結(jié)果顯示,GPC3基因的沉默使huh-7細(xì)胞增殖及遷移能力下降、凋亡率增高。提示該基因在肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控中可能起著關(guān)鍵作用,因而,以GPC3基因?yàn)榘谢虻幕蛑委煂Ω伟┛赡苡行А?br>　　 3.瞬