SFRP5沉默對人膽管癌細胞生物學特性的影響.pdf

1、研究目的：探討使用慢病毒介導短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA。shRNA）沉默SFRP5（secreted frizzled-related proteins-5。SFRP5）基因對人類膽管癌RBE細胞株增殖、遷移以及細胞周期和細胞凋亡的影響。
　　研究方法：對人膽管癌RBE細胞株進行體外培養(yǎng)，制備設計SFRP5干擾片段，使用慢病毒載體pLVX-shRNA2構建慢病毒載體質粒，并進行基因測序鑒定，將構建好的慢病毒s

2、hRNA載體以及輔助質粒共同轉染293T細胞獲得重組慢病毒,利用梯度測定法測定慢病毒滴度，使用FuGENE? HD轉染試劑將慢病毒轉染入RBE細胞株，獲得穩(wěn)定轉染的RBE細胞株，利用 Western blot印跡法檢測SFRP5-siRNA干擾組以及對照組的SFRP5蛋白表達水平變化，通過細胞免疫熒光染色檢測 SFRP5在 RBE細胞中的表達情況，利用 Real-time PCR檢測SFRP5-siRNA干擾組以及對照組mRNA表達水平

3、的變化，通過Transwell細胞遷移實驗以及細胞劃痕實驗研究SFRP5沉默對膽管癌細胞的遷移能力的變化，使用CCK-8法檢測SFRP5低表達對膽管癌細胞增殖水平的影響，利用流式細胞術檢測SFRP5低表達對膽管癌細胞周期以及細胞凋亡的影響。
　　實驗結果：細胞免疫熒光結果顯示RBE細胞株呈SFRP5陽性，故使用RBE細胞實行后續(xù)實驗，將慢病毒RNA干擾慢病毒載體及其輔助包裝原件載體質粒共轉染進293T細胞后，在熒光倒置顯微鏡下可見

4、轉染成功的293T細胞表達綠色熒光，慢病毒濃縮后測得滴度為1×109 TU/ml，測序結果呈陽性；重組慢病毒成功轉染RBE細胞，48h后通過熒光倒置顯微鏡可見綠色熒光，轉染效率約達90％；Western blot結果顯示，與對照組對比，SFRP5-siRNA干擾組組蛋白表達明顯抑制，同時RT-PCR結果顯示。SFRP5-siRNA干擾組細胞株SFRP5基因mRNA表達水平明顯降低（p=0.0087），證實重組SFRP5慢病毒載體能夠有效

5、抑制RBE細胞mRNA和蛋白表達水平；CCK-8法檢測結果顯示，與對照組對比。SFRP5-siRNA干擾組增殖活性明顯增加（p<0.05）；同時Transwell法檢測結果顯示。SFRP5-shRNA-RBE組的穿膜細胞數約為[（310±15.63）個]，較NC-shRNA-RBE組的穿膜細胞數[（75±8.6）個]明顯增加（p<0.05）；同時細胞劃痕實驗結果顯示劃痕后的12h及24h時，SFRP5-siRNA干擾組細胞遷移率顯著大于

6、對照組（p<0.05）；流式細胞術檢測結果顯示，SFRP5-siRNA干擾組細胞凋亡率（2.3%）明顯低于對照組（12.3%），且處于G1期的SFRP5-siRNA干擾組細胞多于對照組（p<0.05）。
　　結論：SFRP5可能在肝內膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調節(jié)作用，SFRP5低表達激活wnt信號通路，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過上述實驗結果，本文得出以下結論：人肝內膽管癌RBE細胞株中，沉默SFRP5基因表達可顯著增強RBE細胞