microRNA-371-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景和目的:結(jié)直腸癌是被確診的第三常見(jiàn)腫瘤，在男性和女性腫瘤相關(guān)死因中居第三位[1]，其在中國(guó)是第4位最常見(jiàn)的惡性腫瘤。隨著生活水平的提高，發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)。但是，其早期的癥狀往往不被人們所發(fā)現(xiàn)，確診時(shí)，病人多已處于進(jìn)展期。因此，識(shí)別有效的結(jié)直腸癌相關(guān)分子，研究其功能特點(diǎn)，不僅有利于很好的理解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，而且也為臨床診斷及治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 microRNA對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控是21世紀(jì)的一個(gè)

2、突破性科學(xué)發(fā)現(xiàn)，大量事實(shí)顯示microRNA與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)[1，2]，通過(guò)抑制其靶基因的表達(dá)，發(fā)揮著“癌基因”或“抑癌基因”的作用。miR-371-5p，又稱miR-371a-5p，是通過(guò)結(jié)直腸癌microRNA芯片篩選出的一個(gè)新的與腫瘤相關(guān)的microRNA，屬于基因間microRNA，編碼基因位于chr19:54，290，929-54，290，995，全長(zhǎng)67bp.與基因內(nèi)microRNA不同之處在于，其表達(dá)無(wú)宿主基因依賴而

3、獨(dú)立的受自身啟動(dòng)子活性狀態(tài)的調(diào)控。目前為止，未見(jiàn)對(duì)miR-371-5p功能的研究，只是在尤文肉瘤，前列腺癌，胃癌的篩查或靶向治療中有文獻(xiàn)提到了miR-371-5p[3-5]。
　　 本研究將從miR-371-5p在人結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用入手，分析其下游作用靶基因及上游調(diào)控分子，并結(jié)合臨床標(biāo)本分析其表達(dá)與臨床病理的關(guān)系。本研究不僅助于理解結(jié)直腸癌進(jìn)展的分子機(jī)制，還為臨床診斷及治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 研究方法:

4、　　 1.miR-371-5p在結(jié)直腸癌中生物學(xué)特性的研究
　　 1)利用結(jié)直腸癌組織microRNA芯片挑選出幾個(gè)與結(jié)直腸相關(guān)的microRNA，并選取8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株，利用real-time RT-PCR檢測(cè)候選microRNAs的表達(dá)。
　　 2)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，將商品化的miR-371-5p inhibitor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和HCT116中，通過(guò)體外增殖及侵襲實(shí)驗(yàn)研究miR-371-5

5、p在結(jié)直腸癌中的作用，確定miR-371-5p為研究對(duì)象。
　　 3)設(shè)計(jì)并構(gòu)建慢病毒載體，a、miR-371過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行病毒包裝后將之感染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620和LoVo中，b、miR-371-5p/shRNA穩(wěn)定干擾載體進(jìn)行病毒包裝后，將之感染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116和SW480中;用有限稀釋法篩選并獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，并行real-time RT-PCR檢測(cè)miR-371-5p的表達(dá)。
　　 4)利用CCK

6、8法、平板克隆形成、流式細(xì)胞儀和體外侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-371或穩(wěn)定干擾miR-371-5p后對(duì)體外結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。
　　 5)利用整體可視化動(dòng)物模型，檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-371或穩(wěn)定干擾miR-371-5p后對(duì)裸鼠皮下成瘤和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 6)從南方醫(yī)院普外科收集77對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織及遠(yuǎn)端正常組織，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-371-5p的表達(dá)情況及與臨床病理的聯(lián)系。
　　

7、 2.miR-371-5p靶基因的篩選及驗(yàn)證
　　 1)以miR-371-5p為檢索詞，在microRNA.org、TargetScan、miRDB和DIANA-microT-CDS四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得分前50的預(yù)測(cè)結(jié)果取交集，即預(yù)測(cè)得到的可信度和準(zhǔn)確性較高的靶基因。
　　 2)利用螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-371-5p與篩選出的靶基因的結(jié)合情況，確定與microRNA直接作用的靶基因。

8、　　 3)利用real-time RT-PCR和Westem blot方法，檢測(cè)miR-371-5p和其靶基因在8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)性分析;并檢測(cè)了過(guò)表達(dá)或干擾miR-371-5p后靶基因的變化情況。
　　 4)將miR-371-5p穩(wěn)定干擾細(xì)胞中干擾靶基因SOX2的表達(dá)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)miR-371-5p在結(jié)直腸癌中生物學(xué)活性的逆轉(zhuǎn)作用。
　　 3.miR-371-5p表達(dá)調(diào)控的探討及其影

9、響因素的排除
　　 1)利用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑氮雜胞嘧啶(5'AZC)及染料木素(Genistein)，處理結(jié)直腸細(xì)胞株，與對(duì)照組比較miR-371-5p的表達(dá)情況。
　　 2)利用UCSC-Ensembl查找miR-371-5p莖環(huán)上游啟動(dòng)子序列并利用Methyprimer分析其啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，通過(guò)在線軟件PromotorScan預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)域， Consite在線軟件預(yù)測(cè)與miR-371-5p啟動(dòng)子區(qū)域相互作用

10、的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 3)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及軟件分析結(jié)果，初定與miR-371-5p啟動(dòng)子區(qū)域相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，利用real-time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子及miR-371-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況并行相關(guān)性分析;利用商品化的轉(zhuǎn)錄因子干擾片段將其瞬時(shí)干擾，檢測(cè)其表達(dá)變化同時(shí)檢測(cè)miR-371-5p的表達(dá)。
　　 4)利用real-time RT-PCR檢測(cè)了miR-371-3p在結(jié)直腸細(xì)胞株及20對(duì)結(jié)直腸組織中的表

11、達(dá)及干擾miR-371-3p后的體外實(shí)驗(yàn)并結(jié)合熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，排除了過(guò)表達(dá)miR-371細(xì)胞株中miR-371-3p對(duì)miR-371-5p實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.miR-371-5p在結(jié)直腸癌中生物學(xué)特性的研究
　　 1)通過(guò)microRNA芯片，挑選了2個(gè)候選microRNA(miR-92b、miR-371-5p)，real-time RT-PCR結(jié)果顯示， miR-371-5p的表達(dá)在

12、8種細(xì)胞株間的表達(dá)具有顯著差異;miR-371-5p在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)最高，且顯著高于SW480、DLD-1、CoLa205、LS174T、HT29、SW620、LoVo細(xì)胞中的表達(dá); miR-371-5p在SW480細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于HT29、SW620和Lovo細(xì)胞中的表達(dá); miR-92b在8種細(xì)胞株間的表達(dá)具有顯著差異，miR-92b在SW620細(xì)胞中的表達(dá)最高，且顯著高于HCT116、SW480、DLD-1、CoLo

13、205、LS174T、HT29、LoVo細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2)將商品化的靶點(diǎn)miR-371-5p inhibitor及miR-92b inhibitor分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HCT116及SW620中發(fā)現(xiàn)，和blank及NC組相比較，轉(zhuǎn)染了miR-371-5p inhibitor的細(xì)胞株SW480及HCT116的增殖能力明顯增強(qiáng)，且體外侵襲能力增強(qiáng)。而轉(zhuǎn)染了miR-92b inhibitor的細(xì)胞株SW62

14、0的增殖能力及侵襲能力未見(jiàn)明顯變化（結(jié)果未顯示）。
　　 3)設(shè)計(jì)并構(gòu)建慢病毒miR-371過(guò)表達(dá)載體及miR-371-5p/shRNA干擾載體，體外實(shí)驗(yàn)顯示:過(guò)表達(dá)miR-371的SW620細(xì)胞及LoVo細(xì)胞的增殖能力顯著減弱，其侵襲能力亦顯著減弱，過(guò)表達(dá)miR-371的LoVo細(xì)胞平板克隆形成能力減弱，而SW620細(xì)胞無(wú)明顯變化; miR-371-5p/shRNA穩(wěn)定干擾的HCT116細(xì)胞及SW480細(xì)胞的平板克隆形成能力顯

15、著增強(qiáng)。EMT相關(guān)分子檢測(cè)中發(fā)現(xiàn):比起NC組，miR-371-5p穩(wěn)定干擾的的SW480細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而Vimentin有輕度上調(diào);比起mock組，過(guò)表達(dá)miR-371的LoVo細(xì)胞，E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，而Vimentin略微下調(diào)。在對(duì)miR-371-5p穩(wěn)定干擾的的HCT116及SW480細(xì)胞行細(xì)胞周期的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，比起NC組，miR-371-5p干擾組在G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，G2/M期的細(xì)胞百分

16、比降低。
　　 4)利用整體可視化動(dòng)物模型觀察到:比起mock組，miR-371過(guò)表達(dá)的LoVo細(xì)胞株皮下成瘤能力減弱（F=9.667，p=0.014），而穩(wěn)定干擾miR-371-5p的HCT116細(xì)胞皮下成瘤能力，相對(duì)NC組而言雖有增強(qiáng)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.667，p=0.343);穩(wěn)定干擾miR-371-5p的HCT116細(xì)胞株腸轉(zhuǎn)移(100％)及肝轉(zhuǎn)移(75％)能力較NC組(40％，0％)強(qiáng)。
　　 5)利用實(shí)時(shí)

17、熒光定量PCR檢測(cè)了77對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織及遠(yuǎn)端正常組織miR-371-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-371-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常粘膜組織。臨床病理分析結(jié)果顯示:miR-371-5p與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生的部位、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度以及腫瘤伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)顯著關(guān)系(p=0.875; p=0.127; p=0.979，p=0.159，p=0.125;p=0.289);而在腫瘤的大小及有無(wú)肝轉(zhuǎn)移上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

18、>　　 2.miR-371-5p靶基因的篩選及驗(yàn)證1)由于microRNA對(duì)靶基因起抑制作用，結(jié)合microRNA的功能及四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果，初定miR-371-5p的靶基因?yàn)镾OX2、SOCS5及BTG3。
　　 2)設(shè)計(jì)并構(gòu)建SOX23'UTR、SOCS53'UTR及BTG33'UTR螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)表達(dá)載體;結(jié)果顯示，在HER293FT細(xì)胞SOX23'UTR及BTG33'UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中，在轉(zhuǎn)染miR-371-5p

19、mimic組與對(duì)照blank組、NC組相比螢光素酶活性均顯著降低，而在SOCS53'UTR熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染miR-371-5p mimic組與blank組、NC組相比螢光素酶活性無(wú)明顯變化。在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染BTG33'UTR螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)HCT116細(xì)胞中，miR-371-5p/inhibitor組與blank組、NC組相比螢光素酶活性無(wú)顯著差異，LoVo細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-371-5p/mimics組與blank組、N

20、C組相比螢光素酶活性無(wú)明顯差異。在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染SOX23'UTR螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)HCT116細(xì)胞中，miR-371-5p/inhibitor組與blank組、NC組相比螢光素酶活性增強(qiáng)，LoVo細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-371-5p/mimics組與blank組、NC組相比螢光素酶活性減弱。
　　 3) Western blot結(jié)果顯示:在8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中SOX2在SW620細(xì)胞中表達(dá)最高，LoVo細(xì)胞中次之。在一定程度上

21、，顯示了miR-371-5p和SOX2之間存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系;比起SW480/NC組，SW480/shRNA組SOX2的表達(dá)上調(diào)，而LoVo/miR-371組中SOX2的表達(dá)顯著低于LoVo/mock組。
　　 4) miR-371-5p過(guò)表達(dá)能下調(diào)靶基因SOX2的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)顯示SOX2的干擾能部分逆轉(zhuǎn)miR-371-5p干擾后在HCTT116及SW480細(xì)胞在細(xì)胞周期及體外侵襲上作用。
　　 3.miR-371-5p

22、表達(dá)調(diào)控的探討及排除miR-371-3p對(duì)miR-371-5p功能的影響
　　 1)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑氮雜胞嘧啶(5-aza-2'-deoxycytidine，AZA)及染料木素(Genistein)處理結(jié)直腸細(xì)胞株后:與NC組比較，miR-371-5p的表達(dá)在SW40、HCT116、HT29及LS174T細(xì)胞株中染料木素(genistein)處理組中顯著上調(diào)，在SW40、HT29及LS174T細(xì)胞株中AZA處理組中上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

23、差異;而染料木素(genistein)處理組的SW620及LoVo細(xì)胞株中及AZA組的HCT116、SW620及LoVo細(xì)胞株中miR-371-5p的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2) Methyprimer軟件分析miR-371-5p上游2500bp啟動(dòng)子區(qū)域無(wú)明顯CpG富集。Consite在線軟件預(yù)測(cè)到的與miR-371-5p核心啟動(dòng)子區(qū)域相互作用的轉(zhuǎn)錄因子SOX17在結(jié)直腸癌中因啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化而表達(dá)下調(diào)。
　　

24、3) SW480細(xì)胞株中SOX17干擾后發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，干擾組的SOX17表達(dá)明顯下調(diào)且miR-371-5p的表達(dá)水平亦顯著下調(diào)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢查結(jié)直腸癌細(xì)胞株中SOX17及miR-371-5p表達(dá)后Spearman相關(guān)性分析顯示，二者存在明顯的正相關(guān)。
　　 4) miR-371-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力及SOX2雙熒光素酶活性無(wú)明顯作用且在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與正常組織相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)

25、論:
　　 1、miR-371-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移能力;
　　 2、miR-371-5p通過(guò)直接抑制靶基因SOX2的表達(dá)，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮其生物學(xué)特性;
　　 3、轉(zhuǎn)錄因子SOX17正向調(diào)節(jié)miR-371-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 本研究的創(chuàng)新之處:
　　 1、首次闡述miR-371-5p在腫瘤中的抑癌作用;
　　 2、提出SOX1