結(jié)直腸癌中RegIV生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤之一。在我國(guó)由于結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸增加，并且其發(fā)病年齡趨向低齡化，因此人們對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制的研究日益增加。
　　腺瘤是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期階段，多數(shù)結(jié)直腸癌是從腺瘤癌變而來的，因此切除腺瘤可以有效地降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率。然而，約30％～46％的腺瘤患者在接受治療后2.5～7年內(nèi)仍會(huì)復(fù)發(fā)，原因在于目前尚缺乏有效的指標(biāo)來預(yù)測(cè)腺瘤的進(jìn)一步演進(jìn)或復(fù)發(fā)。因此對(duì)結(jié)直腸腺瘤發(fā)生機(jī)制的研究對(duì)于結(jié)直腸

2、癌的預(yù)防及治療具有重大意義。
　　盡管人們對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)理進(jìn)行了大量的研究，但至今結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不清楚。早在1999年，我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用抑制性消減雜交法(SSH)（利用一個(gè)同時(shí)患有結(jié)腸腺瘤和腺癌的病例）構(gòu)建了三個(gè)eDNA差減文庫(kù)，在對(duì)腺瘤相對(duì)于正常粘膜的差異片段文庫(kù)(A-N)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)再生基因家族成員RegⅣ在腺瘤中相對(duì)高表達(dá)。
　　再生基因(Regenerating gene，Reg)家族屬于C型植物

3、血凝素超家族。該基因家族成員，均為小分子量的分泌性蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)上具有相似的鈣離子依賴性血凝素結(jié)構(gòu)域。它們與炎癥、組織損傷/修復(fù)、糖尿病及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類Reg家族成員一共有3個(gè)，即RegⅠ，RegⅢ及RegⅣ。與其他人類Reg家族成員不同的是，RegⅣ定位于第一號(hào)染色體上，而其余成員均定位于第二號(hào)染色體。但RegⅣ與Reg家族的其他成員在結(jié)構(gòu)及功能上具有相似性。
　　近年來人們已證實(shí)RegⅣ與結(jié)直

4、腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，然而RegⅣ在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能及效應(yīng)機(jī)制卻研究的不多。為深入研究RegⅣ在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們開展了以下兩部分研究:RegⅣ在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究和RegⅣ在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的效應(yīng)機(jī)制研究。
　　首先通過RT-PCR和Western blot方法尋找RegⅣ陰性和陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RKO和HT29為RegⅣ陰性表達(dá)細(xì)胞株，LoVo和CW2為RegⅣ陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞株。然后

5、我們分別轉(zhuǎn)染RegⅣ表達(dá)質(zhì)粒到RegⅣ陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)，通過G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)RegⅣ的細(xì)胞克隆，分別記為RKO-RegⅣ細(xì)胞株(RKOR)和HT29-RegⅣ細(xì)胞株(HT29R)，它們的對(duì)照組分別記為RKO-Ctrl（RKOC）和HT29-Ctrl細(xì)胞株(HT29C);轉(zhuǎn)染RegⅣ干擾質(zhì)粒到LoVo細(xì)胞株中，同樣通過G418穩(wěn)篩出RegⅣ穩(wěn)定干擾的細(xì)胞克隆LoVo-RegⅣ-shRNA和它的對(duì)照組細(xì)胞克隆LoVo-Ctr

6、l-shRNA;用siRNA片段瞬時(shí)干擾CW2細(xì)胞中RegⅣ的表達(dá)，它的RegⅣ干擾的細(xì)胞記為CW2-siRNA-RegⅣ，對(duì)照組細(xì)胞記為CW2-siRNA-NC。
　　獲得RegⅣ穩(wěn)定表達(dá)/干擾的細(xì)胞克隆后，我們對(duì)這些細(xì)胞克隆進(jìn)行生物學(xué)功能研究，通過EdU法、xCELLigence系統(tǒng)及CCK8方法檢測(cè)RegⅣ表達(dá)/干擾前后細(xì)胞增殖能力變化，未發(fā)現(xiàn)RegⅣ具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力;通過外源性RegⅣ刺激細(xì)胞后同樣發(fā)現(xiàn)RegⅣ未具有

7、促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力;我們又利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示并無顯著差異。利用5-FU誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，分別在24小時(shí)和48小時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的存活率，發(fā)現(xiàn)這幾組細(xì)胞的存活率也無明顯差異。通過Transwell小室和xCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)到RegⅣ表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力均強(qiáng)于它們的對(duì)照組細(xì)胞;而RegⅣ干擾組細(xì)胞的遷移能力比它們的對(duì)照組細(xì)胞有所下降。利用鋪有Matrigel的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，發(fā)現(xiàn)RegⅣ表達(dá)組細(xì)胞

8、的侵襲能力強(qiáng)于它們的對(duì)照組細(xì)胞，干擾組結(jié)果反之。綜上可知RegⅣ具有促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，但未見對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡有影響。因此探索RegⅣ如何誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制是我們下一步所要開展的工作。
　　比較蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)今生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，比較不同生理和病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)和蛋白質(zhì)修飾，對(duì)于揭示生物系統(tǒng)的復(fù)雜生理和病理過程具有十分重要的意義。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric ta

9、gs for relative andabsolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是近年來最新開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)。iTRAQ技術(shù)結(jié)合先進(jìn)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass spectrograph，LC-MS)對(duì)蛋白質(zhì)樣本的分離能力強(qiáng)、分析范圍廣、靈敏度高、可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行平行分析并可以絕對(duì)和相對(duì)定量，因此iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-MS必將成為一種功能更強(qiáng)大的

10、蛋白組學(xué)研究方法。
　　因此我們選用iTRAQ標(biāo)記的比較蛋白組學(xué)方法來探索RegⅣ在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的效應(yīng)機(jī)制，我們用該方法完成了對(duì)1985種蛋白質(zhì)的定量分析。已鑒定出的表達(dá)量上有差異的蛋白質(zhì)是否最終被篩選和認(rèn)定為差異蛋白質(zhì)，還需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的驗(yàn)證。由于RKO和HT29細(xì)胞本身遺傳背景不同，因此它們所得的差異蛋白質(zhì)結(jié)果也存在差異。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，所產(chǎn)生的差異蛋白質(zhì)的篩選結(jié)果如下:RKOR/RKOC組鑒定出6個(gè)顯著下調(diào)和11個(gè)顯著上

11、調(diào)的蛋白質(zhì)，HT29R/HT29C組鑒定出18個(gè)顯著下調(diào)和13個(gè)顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)。因?yàn)槟[瘤的轉(zhuǎn)移過程是多基因、多途徑的過程，因此不同遺傳背景的細(xì)胞所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為RegⅣ分子機(jī)制研究提供更多的信息和線索。我們利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定出的所有差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析，利用蛋白相鄰類的聚簇(cluster of Orthologous Groups of proteins，COG)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類，利用KEGG公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析、確

12、定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。最后我們用Q-PCR檢測(cè)了RKOR/RKOC組中15個(gè)差異基因和HT29R/HT29C組18個(gè)差異基因的表達(dá)情況，其中RKOR/RKOC組中的12個(gè)差異基因和HT29R/HT29C組中的14個(gè)差異基因的Q-PCR結(jié)果與iTRAQ鑒定的結(jié)果一致。我們又用Western blot驗(yàn)證了MRPL12、MAGED2、DBN1、TIP47、MAPK3和S100A11的表達(dá)情況，結(jié)果均與iTRAQ鑒定