磷脂爬行酶1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、磷脂爬行酶1(phospholipidscramblase1，PLSCR1)是一種Ca2+結(jié)合的Ⅱ型膜蛋白。最初的研究認(rèn)為，PLSCR1的主要功能是參與在細(xì)胞激活、損傷或者凋亡過(guò)程中發(fā)生的膜磷脂重新分布。但近來(lái)發(fā)現(xiàn)，PLSCR1的生物學(xué)功能并不局限于細(xì)胞膜磷脂跨膜活動(dòng)，甚至有研究顯示PLSCR1與磷脂跨膜活動(dòng)并沒(méi)有充分或者必要的聯(lián)系。盡管PLSCR1確切的生物學(xué)功能目前尚不明確，但是有越來(lái)越多的證據(jù)表明，PLSCR1可能參與細(xì)胞的增殖、

2、分化和凋亡過(guò)程，并在信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用。在結(jié)直腸腺癌組織中，有報(bào)道PLSCR1的表達(dá)水平高于正常腸粘膜，此外，與健康個(gè)體相比，早期和進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者血漿中PLSCR1水平明顯升高，且早期患者升高更明顯，COX回歸模型顯示PLSCR1高表達(dá)提示患者預(yù)后較差，但其具體作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究對(duì)磷脂爬行酶1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。
　　目的:探討PLSCR1的表達(dá)與結(jié)直腸癌生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系，研究

3、沉默PLSCR1的基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、粘附、遷移和侵襲等行為的影響，探討通過(guò)PLSCR1靶點(diǎn)對(duì)裸鼠移植瘤增殖和侵襲的抑制作用及其機(jī)制。期望通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，為結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展提供預(yù)測(cè)指標(biāo)及潛在治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法分析PLSCR1在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)結(jié)直腸癌及其肝轉(zhuǎn)移癌組織中PLSCR1蛋白的表達(dá)，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　

4、2.使用Western-blot和反轉(zhuǎn)錄PCR方法從蛋白和基因水平檢測(cè)PLSCR1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，復(fù)蘇凍存的PLSCR1蛋白和基因水平表達(dá)相對(duì)較高的和相對(duì)較低的結(jié)直腸癌組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，使用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)方法檢測(cè)PLSCR1表達(dá)差異明顯的結(jié)直腸癌原代細(xì)胞的侵襲能力。
　　3.設(shè)計(jì)三條RNA干擾片段及一條陰性對(duì)照片段，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)PLSCR1的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，采用Western-blot和實(shí)時(shí)定

5、量PCR方法驗(yàn)證干擾結(jié)果，篩選出對(duì)PLSCR1蛋白抑制率最高的干擾片段，通過(guò)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌細(xì)胞粘附能力的變化，通過(guò)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。
　　4.建立荷瘤動(dòng)物模型，通過(guò)siRNA瘤內(nèi)及瘤周注射的方法研究抑制腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)的在體實(shí)驗(yàn)，探討PLSCR1對(duì)裸鼠移植瘤增殖和侵襲的抑制作用及其機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示:PLSCR1在所培養(yǎng)的4株

6、結(jié)直腸癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，主要定位在結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，其中細(xì)胞株Lovo和HR8348表達(dá)相對(duì)細(xì)胞株Colo-320和Sw620更強(qiáng)。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)顯示:PLSCR1在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)率顯著高于正常粘膜。PLSCR1陽(yáng)性表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，PLSCR1表達(dá)陽(yáng)性者術(shù)后5年生存率相對(duì)較低。
　　2.復(fù)蘇人結(jié)直腸癌凍存組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)可以得到存活的腫瘤細(xì)胞用于臨床科學(xué)研究。Western-blot顯示:PL

7、SCR1蛋白在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本。反轉(zhuǎn)錄PCR顯示:PLSCR1mRNA的相對(duì)含量在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的水平顯著高于正常結(jié)直腸黏膜標(biāo)本。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分化程度相仿，PLSCR1表達(dá)較高的結(jié)直腸癌原代細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于PLSCR1表達(dá)相對(duì)較低的結(jié)直腸癌原代細(xì)胞。
　　3.體外構(gòu)建的3對(duì)RNA干擾片段siRNA/390、siRNA/851、siRNA/911均可抑制PL

8、SCR1蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA/390干擾片段抑制效果最明顯。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，siRNA/390干擾下調(diào)PLSCR1的表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞株Lovo增殖變緩，粘附、遷移、侵襲能力下降。
　　4.成功建立了結(jié)直腸癌裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型。局部多點(diǎn)瘤內(nèi)及瘤周注射PLSCR1siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物可顯著抑制裸鼠移植瘤的增殖和侵襲。對(duì)移植瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)顯示:PLSCR1及EGFR