EGFR通路與結(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性的關(guān)系及西妥昔單抗對(duì)結(jié)直腸癌放療敏感性的影響.pdf

1、一、研究背景
　　 結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，目前在全世界惡性腫瘤的發(fā)病率中占第3位，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展導(dǎo)致飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)。根據(jù)結(jié)直腸腫瘤分期的不同，結(jié)直腸癌5年生存率介于10-90％之間。直腸是結(jié)直腸腫瘤最易發(fā)部位，在西方國(guó)家中直腸癌約占結(jié)直腸癌總發(fā)病率40％，而我國(guó)卻占總發(fā)病率的60％左右，并以腹膜返折平面以下的中低位直腸癌占大多數(shù)。由于直腸癌深處盆腔，與結(jié)腸癌相比，直腸癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)

2、率高、遠(yuǎn)期生存率低，而局部進(jìn)展期直腸癌則預(yù)后更差，其5年生存率位于20-40％之間。因此，如何有效預(yù)防直腸癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)和提高直腸癌患者總生存率和無(wú)病生存率一直是直腸癌研究的重點(diǎn)。
　　 自20世紀(jì)80至90年代美國(guó)進(jìn)行的多個(gè)腫瘤研究項(xiàng)目顯示直腸癌術(shù)后放化療可以減少局部復(fù)發(fā)率和提高總體生存率以后，手術(shù)、放療和化療組成了直腸癌綜合治療的三大支柱，20世紀(jì)后期手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放化療是局部晚期直腸癌患者的經(jīng)典治療方案。而近10年來多個(gè)大樣

3、本多中心臨床研究表明術(shù)前放化療與術(shù)后相比可以達(dá)到提高保肛率、R0切除率及進(jìn)一步減少局部復(fù)發(fā)率的作用，因此術(shù)前放化療作為局部進(jìn)展期直腸癌輔助治療的重要手段目前建議在術(shù)前進(jìn)行，術(shù)前放化療聯(lián)合手術(shù)已經(jīng)成為局部進(jìn)展期直腸癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，目前多學(xué)科綜合治療在提高局部進(jìn)展期直腸癌總體治療效果中的作用已經(jīng)得到公認(rèn)。根據(jù)局部進(jìn)展期直腸癌患者對(duì)術(shù)前放化療的敏感程度制定個(gè)性化治療方案及在放療過程中聯(lián)合使用化療及分子靶向治療以進(jìn)一步提高局部進(jìn)展期中低位直腸

4、癌術(shù)前放化療效果則是目前直腸癌臨床研究的熱點(diǎn)。
　　 EGFR通路在腫瘤放療抵抗中的作用既往已有相關(guān)研究報(bào)道，但EGFR信號(hào)向下轉(zhuǎn)導(dǎo)有兩條途徑，通路具有多節(jié)點(diǎn)性，目前尚無(wú)相關(guān)研究同時(shí)探討K-ras/B-raf/PIK3CA突變與結(jié)直腸癌放療敏感性的關(guān)系，我們從細(xì)胞學(xué)水平探討EGFR通路多節(jié)點(diǎn)與放療敏感性的關(guān)系。由于表皮生長(zhǎng)因子與放療抵抗相關(guān)，而氟尿嘧啶目前廣泛應(yīng)用于術(shù)前放療增敏，目前尚無(wú)相關(guān)研究西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)放療效果

5、的影響，因此我們分別從細(xì)胞水平、結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞裸鼠模型并對(duì)臨床研究進(jìn)行系統(tǒng)回顧探討了西妥昔單抗聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性的影響。
　　 二、研究?jī)?nèi)容
　　 第一部分表皮生長(zhǎng)因子通路與結(jié)直腸癌細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系
　　 目的探討表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)及其下游通路的關(guān)鍵基因K-ras/B-raf/PIK3CA突變狀態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞放射敏感性的影響。方法對(duì)9個(gè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系應(yīng)用RealTime

6、RT-PCR技術(shù)及Western blotting檢測(cè)EGFR在mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)高低，同時(shí)檢測(cè)這9個(gè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系K-ras、B-raf、 PIK3CA的突變狀態(tài)，對(duì)這9個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系行2Gy劑量射線照射，對(duì)照射后的細(xì)胞行克隆形成實(shí)驗(yàn)明確各細(xì)胞株放射敏感特性，照射48小時(shí)后行Hoechst33258染色凋亡形態(tài)學(xué)觀察，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期比例，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)直腸癌細(xì)胞EGFR表達(dá)及K-ras、B-raf、

7、PIK3CA突變狀態(tài)與放療敏感性的關(guān)系并分析放療抵抗及敏感的可能機(jī)制。結(jié)果相關(guān)性分析顯示結(jié)直腸癌細(xì)胞系EGFR表達(dá)與放療抵抗成正相關(guān)(r=0.717，P=0.030)，EGFR高表達(dá)與放療抵抗相關(guān)，而PIK3CA突變與放療敏感相關(guān)(t=2.401，P=0.047)，K-ras、B-raf突變與放療抵抗及敏感無(wú)關(guān)。照射后48h凋亡檢測(cè)顯示放療敏感細(xì)胞系(HCT116)總凋亡率隨放射劑量增加明顯增加(P＜0.05)，而放療抵抗細(xì)胞系(HT2

8、9)總凋亡率只有放射劑量明顯較大才增加，細(xì)胞周期檢測(cè)顯示放療敏感系(HCT116)的G1/G0期比例隨放療劑量增加顯著降低(P＜0.05)，而放療抵抗細(xì)胞株細(xì)胞系(HT29)G1/G0期比例在放療劑量增加時(shí)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。結(jié)論人結(jié)直腸癌細(xì)胞系EGFR高表達(dá)與放療抵抗顯著相關(guān)，PIK3CA突變與放療敏感顯著相關(guān)，EGFR通路多位點(diǎn)同時(shí)參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療抵抗和敏感作用，EGFR通路參與結(jié)直腸癌細(xì)胞放療抵抗機(jī)制可能與抑制腫瘤

9、細(xì)胞凋亡、增加腫瘤細(xì)胞在G1/G0期停頓相關(guān)。
　　 第二部分放療對(duì)直腸癌EGFR表達(dá)影響與放療敏感性和預(yù)后關(guān)系
　　 目的分析放療前后局部進(jìn)展期中低位直腸癌患者癌組織EGFR蛋白水平表達(dá)的變化，探討放療前后EGFR蛋白表達(dá)變化與病理消退及預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步全面研究局部進(jìn)展期中低位直腸癌患者新輔助治療后病理消退的臨床及病理影響因素。方法對(duì)2002年1月至2009年12月期間122例局部進(jìn)展期中低位直腸癌患者接受新輔助治療

10、后行手術(shù)的臨床資料及術(shù)后病理消退分級(jí)進(jìn)行回顧性研究，對(duì)其中46例患者放療前后直腸癌組織病理標(biāo)本進(jìn)行EGFR免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá)高低，Logistic回歸分析與直腸癌新輔助治療后病理消退相關(guān)的臨床及病理影響因素，生存分析及Log-rank檢驗(yàn)探討EGFR表達(dá)變化及其他臨床病理因素與預(yù)后的關(guān)系，COX多因素回歸分析與新輔助治療后直腸癌患者長(zhǎng)期生存相關(guān)的獨(dú)立影響因素。結(jié)果122例患者中明顯病理消退52例(42.62％)，其中完全病理消退1

11、1例(9.02％)，病理消退不明顯70例(57.38％)。同步放化療患者病理明顯消退率為54.05％(40/74)，高于單純放療患者病理明顯消退率25％(12/48)(X2=10.5，P=0.002)，長(zhǎng)程放療方案患者病理明顯消退率為60％(30/50)，高于短中程放療患者病理明顯消退率30.56％(22/72)(X2=10.465，P=0.005)，放療總量大于4000 cGy患者病理明顯消退率為60.42％(29/48)，高于放療總

12、量小于等于4000 cGy患者病理明顯消退率31.08％(23/74)(X2=10.889，P=0.002)，放療后EGFR表達(dá)增加病理明顯消退率為23.03％(3/13)，低于放療后EGFR表達(dá)不變或減少患者病理明顯消退率63.64％(21/33)(X2=7.769，P=0.005)，多因素Logistic回歸分析顯示同步放化療、長(zhǎng)程放療及放療后EGFR蛋白表達(dá)不變或減少是局部進(jìn)展期直腸癌患者術(shù)前新輔助治療后病理消退分級(jí)的三個(gè)獨(dú)立影響

13、因素(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示本組患者總體生存率65.8％，生存分析及Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示組織學(xué)類型(P=0.025)、CEA水平（P=0.032）、腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.022)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)、隨訪過程中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.002)、放療前EGFR蛋白高表達(dá)(P=0.024)及放療后EGFR表達(dá)增加(P=0.007)對(duì)患者長(zhǎng)期生存有顯著影響，總體生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，

14、COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)單因素分析有意義的各因素行多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、隨訪過程中遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移以及放療前后EGFR蛋白表達(dá)變化均是影響患者生存的獨(dú)立因素(P=0.024、P=0.042、P=0.023)，因此放療后EGFR蛋白表達(dá)增加、術(shù)后標(biāo)本淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及隨訪過程中遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致新輔助治療后直腸癌患者長(zhǎng)期生存減少的三個(gè)獨(dú)立影響因素，其中隨訪過程中遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比放療前后EGFR蛋白表達(dá)變化對(duì)生存影響更為密切。結(jié)論局

15、部進(jìn)展期中低位直腸癌患者行術(shù)前放化療可以引起EGFR蛋白表達(dá)的變化，局部進(jìn)展期中低位直腸癌患者中行同步放化療、長(zhǎng)程放療方案及放療后EGFR蛋白表達(dá)未增加者臨床療效優(yōu)于單純放療、短中程放療及放療后EGFR蛋白表達(dá)增加者，放療后EGFR蛋白表達(dá)增加不僅與局部進(jìn)展期直腸癌患者放療抵抗相關(guān)，而且預(yù)示接受術(shù)前放療中低位直腸癌患者的預(yù)后不良。
　　 第三部分西妥昔單抗聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞放療敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究及系統(tǒng)回顧
　　

16、 目的分析評(píng)估表皮生長(zhǎng)因子拮抗劑西妥昔單抗聯(lián)合氟尿嘧啶對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞及中低位直腸癌患者術(shù)前放療效果的影響。方法根據(jù)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO在體外培養(yǎng)過程中給予不同干預(yù)措施分為2Gy射線照射組、氟尿嘧啶聯(lián)合2Gy射線照射組、西妥昔單抗聯(lián)合2Gy射線照射組、氟尿嘧啶及西妥昔單抗聯(lián)合2Gy射線照射組，對(duì)各組細(xì)胞行CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同干預(yù)后的細(xì)胞增殖情況，干預(yù)48小時(shí)后各組細(xì)胞行Hoechst33258染色凋亡形態(tài)學(xué)觀察，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干預(yù)4

17、8小時(shí)后各組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期比例，統(tǒng)計(jì)分析不同干預(yù)方式對(duì)RKO結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖的影響，利用RKO行裸鼠成瘤，對(duì)成瘤裸鼠同樣分為四組分別給予2Gy射線照射、氟尿嘧啶聯(lián)合2Gy射線照射、西妥昔單抗聯(lián)合2Gy射線照射、氟尿嘧啶及西妥昔單抗聯(lián)合2Gy射線照射。檢索PubMed，EMBASE，ISI數(shù)據(jù)庫(kù)及Cochrane圖書館，對(duì)2012年12月前所有將西妥昔單抗用于術(shù)前放療增敏的臨床研究進(jìn)行系統(tǒng)回顧。結(jié)果西妥昔單抗組及氟尿嘧啶組各自單獨(dú)

18、聯(lián)合放療均明顯提高了放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但是氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗與各自單用相比對(duì)提高放療的效果不明顯，抑制率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。西妥昔單抗及氟尿嘧啶各自與2Gy放射線聯(lián)合均明顯提高了2Gy放射線單獨(dú)照射的凋亡率，而氟尿嘧啶與2Gy放射線聯(lián)合提高2Gy放射線單獨(dú)照射的凋亡率更加明顯，使用西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy放射線單獨(dú)照射的凋亡率并不比氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy放

19、射線單獨(dú)照射的凋亡率更明顯，西妥昔單抗與2Gy放射線聯(lián)合明顯降低了G1/G0期腫瘤細(xì)胞的比例(P＜0.05)，而氟尿嘧啶與2Gy放射線聯(lián)合則導(dǎo)致細(xì)胞周期檢測(cè)出現(xiàn)一個(gè)明顯的凋亡峰，Hoechst33258檢測(cè)顯示研究組（2Gy照射+氟尿嘧啶組及2Gy照射+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組）均出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示2Gy照射+氟尿嘧啶組，2Gy照射+西妥昔單抗組，2Gy照射+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組各組瘤體重量均明顯低于對(duì)照

20、組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而2Gy照射組雖然瘤體重量低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果還顯示2Gy照射+氟尿嘧啶組瘤體重量明顯低于2Gy照射+西妥昔單抗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，雖然2Gy照射組瘤體重量與對(duì)照組相比及2Gy照射+西妥昔單抗組的瘤體重量與2Gy照射組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但是2Gy照射+西妥昔單抗組的瘤體重量與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。共14項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨

21、床研究納入522例患者探討了西妥昔單抗對(duì)局部進(jìn)展期中低位直腸癌患者術(shù)前放療增敏，pCR率0-20％，西妥昔單抗聯(lián)合放療總pCR為10.73％，低于氟尿嘧啶聯(lián)合放療總13.5％。結(jié)論西妥昔單抗提高放療敏感性主要通過改變細(xì)胞周期，減少引起對(duì)放療損傷逃逸的G1/G0期細(xì)胞的比例，而氟尿嘧啶提高放療敏感性主要通過增加細(xì)胞凋亡，氟尿嘧啶與西妥昔單抗相比增加放療敏感性更加顯著。氟尿嘧啶、西妥昔單抗各自單藥均明顯增加了2Gy照射對(duì)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制