Hsa-miR-622靶向調(diào)控RB1抑制中晚期低位直腸癌放療敏感性的初步研究.pdf

1、背景和目的:
　　 我國結直腸癌的流行病學特點提示直腸癌尤其是低位直腸癌仍是影響群眾健康的重要疾病。其流行病學有著自身的特點:一是發(fā)病年齡偏低，我國大腸癌的中位發(fā)病年齡大約是45歲，比歐美國家提前12～18年;二是直腸癌特別是中下段直腸癌多見——約70％左右的大腸癌為直腸癌，而70％的直腸癌位于距肛緣8cm以下;三是患者就診時多屬中晚期，極大地影響了治療效果，5年生存率一直在低水平徘徊。術前新輔助放療成為中晚期低位直腸癌的重要治

2、療手段，但其有效性只有70％左右，而目前缺少有效的預測患者放療敏感性的生物學指標。因此尋找有價值的放療敏感性預測指標是本研究的重點。
　　 術前新輔助放療業(yè)已成為進展期中低位直腸癌治療的標準方案，尋找預測放療敏感性的分子標記值得深入研究。近年來，隨著歐美幾宗大樣本隨機對照研究的完成，提示進展期直腸癌的輔助放療更傾向于術前實施。主要理由是:術前腫瘤周圍區(qū)域血運未被破壞、血供好、氧合程度高，放療效果確切;且于術前行新輔助放療后腫瘤降

3、期明顯、切緣陰性率高、保肛概率大;術前行輔助放療對腫瘤的局部控制率優(yōu)于術后實施;同時，術前實施的不良反應明顯低于術后。更有文獻報道，術前放療可提高病人的長期生存率。但是，直腸癌是一種腺癌，其整體對單純放射治療不如鱗癌、惡性淋巴瘤等敏感，對放療有明顯效果、部分效果和效果不明顯的病人各占約1/3左右，總有效率約為70％，近30％患者從新輔助放療中獲益較少，甚至只增加了治療毒性反應，反而有延誤病情之虞。因此，尋找有關直腸癌放射敏感性的分子標記

4、，更好地對病人進行個性化篩選應是當前研究的重點。許多研究試圖找到有關直腸癌放療敏感性的生物學標志物以更好的對病人進行選擇，包括P53和P21等，但在臨床上尚難以得到廣泛的應用。目前主要的方法還是依據(jù)腫瘤的臨床特征，包括腫瘤的大小、活動度，腫瘤分化程度以及影像學檢查提示的腫瘤分期等進行篩選，而這些臨床指標均缺乏與腫瘤放療敏感的相關性。因而預測放療敏感性的新型分子標記值得探尋。
　　 microRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過程，

5、在外周血和組織中都可穩(wěn)定存在并可通過現(xiàn)有手段進行相對定量，有望成為腫瘤診斷的新型分子標記。Giuseppina Della Vittoria Scarpati等人選取了38例中晚期地位直腸癌患者的放療前標本，對標本進行microRNA芯片篩選并用熒光實時定量PCR進行驗證，并結合超聲內(nèi)鏡對患者放療前后腫瘤緩解程度的評價，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-622和hsa-miR-630預測中晚期低位直腸癌放療敏感與否，其敏感性和特異性都達到100％。經(jīng)

6、過篩選，我們選擇了hsa-miR-622作為研究對象。Hsa-miR-622是由位于染色體13q31.3的基因編碼，據(jù)PNAS報道，hsa-miR-622與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展有重要關系。
　　 方法:
　　 一、hsa-miR-622在細胞和組織水平的差異表達及其與放療敏感性的關系
　　 1、熒光實時定量PCR檢測hsa-miR-622在SW480、HT29、HCT116、LS174.T、SW837、HR8348

7、細胞中的內(nèi)源性表達。對SW480、HT29、HCT116、LS174.T、SW837、HR8348分別給予2、3、4、5Gy的放療劑量進行處理，利用CCK-8和平板克隆形成實驗觀測放療后細胞增殖情況，摸索適合的放療劑量并對比不同細胞株的放療敏感性差異。
　　 2、分別將六株細胞注射到裸鼠皮下，待其成瘤后，取荷瘤裸鼠腫瘤組織，通過熒光實時定量PCR檢測荷瘤裸鼠腫瘤組織中hsa-miR-622的表達。腫瘤最大直徑至10mm后，對荷瘤

8、裸鼠按臨床治療劑量進行放療處理，用游標卡尺記錄放療組和未放療組腫瘤的大小變化情況。以腫瘤縮減率（未放療組腫瘤最大直徑-放療組腫瘤最大直徑/未放療組腫瘤最大直徑）作為評價腫瘤的放療敏感性的指標，對比內(nèi)源性hsa-miR-622的表達與荷瘤裸鼠放療敏感性的關系。
　　 3.收集進展期中低位直腸癌患者的放療前腫瘤組織活檢標本，共17例。熒光實時定量PCR檢測17例進展期中低位直腸癌患者放療前活檢標本中hsa-miR-622的表達。根據(jù)

9、南方醫(yī)院病歷管理系統(tǒng)中所記錄的放療前后CT、腸鏡以及術后病理報告對比患者放療敏感性的差異，利用Mandard腫瘤緩解程度分級的標準對患者放療后腫瘤緩解程度進行分級。
　　 二、沉默和過表達hsa-miR-622對結直腸癌細胞及荷瘤裸鼠敏感性的影響
　　 1.利用細胞瞬時轉(zhuǎn)染實驗，選擇SW480和HCT116兩株細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染，其中SW480對hsa-miR-622進行干擾，而HCT116則轉(zhuǎn)入mimics模擬過表達hs

10、a-miR-622，熒光實時定量PCR檢測細胞瞬時轉(zhuǎn)染效率。對細胞進行放療處理，利用PI染色后進行流式細胞實驗對比細胞的放療敏感性變化。
　　 通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術獲得穩(wěn)定過表達和沉默hsa-miR-622的細胞株，熒光實時定量PCR檢測四株細胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率，利用細胞增殖實驗（CCK-8和平板克隆形成實驗）對比在轉(zhuǎn)染慢病毒后細胞放療敏感性的變化。
　　 2、將穩(wěn)定過表達組、沉默組細胞和N.C組分別注射到裸鼠皮下。待荷瘤裸

11、鼠腫瘤最大直徑約10mm左右后，對荷瘤裸鼠按臨床治療劑量進行放療處理，用游標卡尺記錄放療組和未放療組腫瘤的大小變化情況。以腫瘤縮減率（未放療組腫瘤最大直徑-放療組腫瘤最大直徑/未放療組腫瘤最大直徑）作為評價腫瘤的放療敏感性的指標，將對照組和沉默組、對照組和過表達組進行對比。對比荷瘤裸鼠在沉默和過表達hsa-miR-622后放療敏感性的變化。
　　 三、hsa-miR-622的靶基因的預測及表達特性分析
　　 1、以hsa

12、-miR-622為檢索詞，檢索microRNA.org、TargetScan兩個數(shù)據(jù)庫進行靶基因的預測。將2個數(shù)據(jù)庫的預測結果取交集后，對所得靶基因進行GO分類，同時利用DAVID數(shù)據(jù)庫對分類結果進驗證，最后根據(jù)microRNA.org數(shù)據(jù)庫對基因作用的注解及評分選取目的靶基因。
　　 2、構建預測所得靶基因的3'UTR表達載體以及將hsa-miR-622結合位點突變后的3,UTR的突變載體。在工具細胞293FT中利用雙螢光素酶

13、報告系統(tǒng)驗證hsa-miR-622是否能夠與預測所得基因的3'UTR區(qū)相結合并對預測所得靶基因的表達產(chǎn)生抑制，并在直腸癌細胞株SW837中驗證。
　　 3、western-blot檢測裸鼠皮下腫瘤組織內(nèi)源性及在沉默和過表達后RB1基因的差異表達，對比荷瘤裸鼠放療敏感性與RB1表達強弱的關系，分析RB1的表達與放療敏感性的關系。
　　 4、免疫組化染色檢測中晚期直腸癌患者的放療前活檢石蠟標本中RB1的表達，對比個體間RB1

14、的表達差異與患者放療敏感性的關系5、western-blot檢測直腸癌細胞株HCT116中RB1、E2F1、E2F8三個蛋白在放療后1-8h的表達情況，探討三個蛋白間的相互作用。
　　 結果:
　　 一、hsa-miR-622在細胞水平和組織水平的差異表達及其與放療敏感性的關系
　　 1、熒光實時定量PCR檢測hsa-miR-622在SW480、HT29、HCT116、LS174.T、SW837、HR8348細胞

15、中的表達。以Ls174.T細胞的表達為參照組，對結果通過單因素方差分析顯示:5種細胞株中hsa-miR-622的表達量之間差異具有顯著性（F=118.335，P＜0.001）。方差齊性檢驗顯示方差齊性，LSD兩兩比較后發(fā)現(xiàn):HR8348細胞當中hsa-miR-622的表達量最高，且高于SW480(P＜0.001)、HT29(P＜0.001)、HCT116(P＜0.001)、SW837(P＜0.001)細胞中的表達;hsa-miR-622

16、表達較高的是SW480細胞，且高于HT29(P＜0.001)、HCT116(P＜0.001)、SW837(P＜0.001)細胞中的表達;hsa-miR-622在HT29中的表達高于HCT116（P=0.032）、SW837(P=0.018)。而hsa-miR-622表達較低的兩株細胞之間無統(tǒng)計學差異SW837與HCT116（P=0.741）。hsa-miR-622在HR8348、SW480、HT29、HCT116、SW837、LS174

17、.T中依次降低。在HR8348、SW480、HT29表達相對較高，在HCT116、SW837、LS174.T表達相對較低，對SW480、HT29、HCT116、LS174.T、SW837、HR8348分別給予2、3、4、5Gy的放療劑量進行處理后，CCK-8、平板克隆形成實驗以檢測細胞放療敏感性顯示SW480、HT29、HR8348對放療不敏感，而HCT116、Ls174.T、SW837對放療敏感。我們發(fā)現(xiàn)hsa-miR-622的內(nèi)源性

18、表達與細胞的放療敏感性負相關。
　　 2、熒光定量PCR檢測荷瘤裸鼠腫瘤組織中hsa-miR-622的表達，以Ls174.T為參照組，將其他5個實驗組進行單因素方差分析結果顯示:五株細胞株在裸鼠皮下成瘤后，檢測腫瘤組織hsa-miR-622表達結果有統(tǒng)計學差異（F=315.155P＜0.001）。方差齊性檢驗顯示方差不齊，Dunnett T3兩兩比較后發(fā)現(xiàn):HR8348細胞當中hsa-miR-622的表達量最高，且高于SW480

19、(P=0.011)、HT29(P=0.002)、HCT116(P=0.004)、SW837(P=0.003)細胞中的表達;hsa-miR-622表達較高的是SW480細胞，且高于HT29(P=0.066)、HCT116(P=0.022)、SW837(P=0.016)細胞中的表達;hsa-miR-622在HT29中的表達比HCT116(P=0.008)、SW837(P=0.005)細胞中的表達。而hsa-miR-622表達較低的兩株細胞中

20、HCT116的表達要高于SW837(P＜0.001)的表達。HR8348、SW480、HT29、HCT116、LS174.T、SW837在裸鼠皮下成瘤后，腫瘤組織中hsa-miR-622的表達依次降低，在HR8348、SW480、HT29表達相對較高，在HCT116、SW837、LS174.T表達相對較低。對比荷瘤裸鼠在注射不同結直腸癌細胞株的放療敏感性差異，結果顯示:不同細胞株在裸鼠皮下成瘤后，腫瘤組織放療敏感性有統(tǒng)計學差異（F=6.

21、141 P=0.005）。LSD兩兩比較結果顯示，注射HT29細胞的荷瘤裸鼠放療敏感性要低于HCT116(P=0.002)、Ls174.T（P=0.008）和SW837（P=0.024），與HR8348（P=0.829）和SW480（P=0.984）無統(tǒng)計學差異。注射SW480的荷瘤裸鼠放療敏感性要低于HCT116（P=0.004）、Ls174.T（P=0.012）和SW837（P=0.036），與HR8348(P=0.845)相比無統(tǒng)

22、計學差異。注射HR8348的荷瘤裸鼠放療敏感性要低于HCT116（P=0.002）、Ls174.T（P=0.008）和SW837(P=0.025)。HCT116與Ls174.T(P=0.522)、Ls174.T與SW837(P=0.562)、SW837與HCT116（P=0.233）之間放療敏感性無統(tǒng)計學差異。我們發(fā)現(xiàn)hsa-miR-622在荷瘤裸鼠腫瘤組織中的內(nèi)源性表達與其放療敏感性負相關3、收集17例進展期中低位直腸癌患者的放療前瘤

23、組織標本，檢測其中hsa-miR-622的表達。并利用南方醫(yī)院病歷管理系統(tǒng)中記錄的CT、腸鏡以及術后病理報告，對比臨床患者的放療敏感性差異情況，利用Mandard腫瘤緩解程度分級的標準對患者進行分級。17例標本中，5例患者經(jīng)過Mandard腫瘤緩解程度分級為TRG4，其hsa-miR-622的表達水平較高，而在相對最低表達的3例患者均達到完全緩解。
　　 二、沉默和過表達hsa-miR-622對結直腸癌細胞及荷瘤裸鼠放療敏感性的

24、影響
　　 1、熒光實時定量PCR檢測細胞轉(zhuǎn)染效率，對結果進行t檢驗顯示hsa-miR-622在SW480 N.C中的表達要高于SW480 IN中的表達（t=13.313，P=0.006），結果具有統(tǒng)計學差異而HCT116N.C中的表達要低于HCT116hsa-miR-622中的表達（t=13.313，P=0.008）。說明瞬時轉(zhuǎn)染對hsa-miR-622的表達產(chǎn)生影響。對細胞進行放療處理，利用PI染色后進行流式細胞實驗對比細胞

25、的放療敏感性變化。發(fā)現(xiàn)mimics轉(zhuǎn)染的細胞株與對照組相比，放療敏感性下降（t=16.186，P＜0.001），而inhibitor轉(zhuǎn)染后的細胞株與對照組相比，放療敏感性增強（t=13.556，P＜0.001）。熒光實時定量PCR檢測四株細胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率，采用單樣本t檢驗對結果進行分析，在干擾組中SW480 IN的hsa-miR-622的表達與SW480 N.C組相比無統(tǒng)計學差異(t=4.285，P=0.050);而HT29IN的hs

26、a-miR-622表達要高于HT29 N.C（t=5.387，P=0.033）;在過表達組中HCT116hsa-miR-622的表達與HCT116 N.C組相比無統(tǒng)計學差異（t=2.853，P=0.104）;SW837 hsa-miR-622的表達要高于SW837 N.C組的表達（t=5.541，P=0.031）。同時利用細胞增殖實驗（CCK-8和平板克隆形成實驗）對比在轉(zhuǎn)染慢病毒后細胞放療敏感性的變化，結果顯示:與對照組相比，沉默組細

27、胞株放療敏感性增強，而在過表達組中，細胞放療敏感性減弱。
　　 2、對荷瘤裸鼠在沉默和過表達hsa-miR-622后放療敏感性的變化。結果顯示:注射SW480 IN的荷瘤裸鼠比注射SW480 N.C的荷瘤裸鼠的腫瘤縮減率明顯（t=5.572，P=0.005）。注射HCT116 N.C的荷瘤裸鼠比注射HCT116 hsa-miR-622的荷瘤裸鼠的腫瘤縮減率明顯（t=3.283，P=0.030）。注射SW837 N.C的荷瘤裸鼠比

28、SW837 hsa-miR-622的荷瘤裸鼠腫瘤縮減率明顯（t=2.917，P=0.043）。
　　 三、hsa-miR-622的靶基因預測及表達特性分析
　　 1、通過軟件預測分析并查閱相關文獻，最終得到hsa-miR-622的靶向調(diào)控基因RB1。
　　 2、在工具細胞293FT中，雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果顯示，在轉(zhuǎn)染克隆有RB1基因3'UTR質(zhì)粒的實驗組中，單因素方差分析結果顯示:組間存在統(tǒng)計學差異（F=139

29、.970，P＜0.001）。LSD進行兩兩比較:hsa-miR-622組與blank組相比螢光素酶活性降低(P＜0.001)，hsa-miR-622組與N.C組相比螢光素酶活性降低(P＜0.001)。blank組和N.C組相比熒光素酶活性未見明顯變化(P=0.838)，說明對照轉(zhuǎn)染序列未對熒光素酶活性產(chǎn)生影響。Hsa-miR-622 inhibitor與N.Cinhibitor組（P=0.168）和blank組(P=0.231)相比，螢

30、光素酶活性均差異無統(tǒng)計學意義。在轉(zhuǎn)染克隆有MutRB1基因3'UTR質(zhì)粒的實驗組中，單因素方差分析結果顯示各組間熒光素酶活性無統(tǒng)計學差異（F=2.397，P=0.120）。證明hsa-miR-622能與RB1基因3,UTR結合，從而抑制了螢光素酶的活性。這以結果也在SW837細胞中得到驗證。
　　 3、不同細胞在裸鼠皮下成瘤后，western-blot檢測腫瘤組織內(nèi)源性RB1的表達，對比裸鼠放療敏感性與RB1表達強弱的關系，發(fā)現(xiàn)

31、在RB1高表達的組織中，荷瘤裸鼠對放療更敏感。同時檢測注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的裸鼠腫瘤組織中的RB1表達，分析其與放療敏感性的關系。結果顯示:發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染hsa-miR-622過表達慢病毒的細胞在皮下成瘤后的腫瘤組織中RB1的表達較N.C組降低，而在干擾組中RB1表達升高。在放療敏感性方面，與N.C組相比，過表達組荷瘤裸鼠放療敏感性降低，抑制組放療敏感性增加。
　　 4、免疫組化染色檢測中晚期直腸癌患者的放療前活檢石蠟標本中RB1的表達

32、，對比個體間RB1的表達情況與患者對放療敏感性的關系，結果顯示RB1在27例患者中均呈強陽性表達，個體間無統(tǒng)計學差異。
　　 5、western-blot檢測RB1、E2F1、E2F8三個蛋白在放療后1-8h的直腸癌細胞株中的表達情況。結果顯示:三個白蛋白在放療后1-8h都有先降低再升高最后降低的變化過程。他們之間的關系有待進一步的研究。
　　 結論：
　　 Hsa-miR-622的差異表達結直腸癌細胞的放療敏感