沉默DNA-PKcs、ATM表達對HeLa細胞生物學行為及放療敏感性的影響.pdf

1、研究背景：
　　宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在女性所有惡性腫瘤中居第4位，但是在部分發(fā)展中國家，由于宮頸癌篩查不到位，其發(fā)病率可以居女性惡性腫瘤首位。據(jù)統(tǒng)計全世界每年約有新發(fā)宮頸癌患者528,000例，因?qū)m頸癌導(dǎo)致的死亡約為266,000例，其中85％左右發(fā)生在發(fā)展中國家。宮頸癌是唯一明確病因的惡性腫瘤，持續(xù)的高危HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌的原因，其中HPV16/18兩種病毒感染導(dǎo)致的宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的80%左右。
　　

2、目前宮頸癌的治療主要包括手術(shù)、放療和化療。放療是宮頸癌的重要治療方法，特別對晚期宮頸癌患者。放射線能引起細胞DNA雙鏈斷裂（DSB），如果不能及時修復(fù)可導(dǎo)致細胞死亡。細胞中存在著對其存活至關(guān)重要的DNA損傷修復(fù)通路。腫瘤細胞對放療導(dǎo)致DNA損傷的修復(fù)能力是引起其對放療不敏感的重要原因。目前較為公認的DSB修復(fù)機制主要有兩種：非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修復(fù)，哺乳動物細胞以NHEJ修復(fù)為主。DNA-PKcs和ATM分別

3、在NHEJ和HR修復(fù)中起重要作用。
　　臨床研究表明DNA-PKcs和ATM高表達的腫瘤患者疾病進展較快，對放療不敏感，預(yù)后較差。細胞實驗表明，通過RNA干擾抑制癌細胞DNA-PKcs或ATM的表達能增加其對放療的敏感性，并且對其部分惡性生物學行為有一定影響。但是還沒有研究同時抑制DNA-PKcs和ATM表達檢測其對宮頸癌細胞惡性生物學行為及放療敏感性的影響。
　　研究目的：
　　探討抑制HeLa細胞DNA-PKcs、

4、ATM的表達后，對其生物學行為及放療敏感性的影響。
　　材料與方法：
　　1.構(gòu)建干擾質(zhì)粒：將針對DNA-PKcs和ATM的干擾RNA分別及同時連入質(zhì)粒，合成含針對DNA-PKcs、ATM及DNA-PKcs+ATM的干擾質(zhì)粒。
　　2.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株及檢測沉默效果：將干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 HeLa細胞，嘌吟霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。用Western Blot和Quantitative Real-time PCR檢測

5、未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞組（對照組），轉(zhuǎn)染干擾DNA-PKcs表達HeLa細胞組（DNA-PKcs組），轉(zhuǎn)染干擾ATM表達HeLa細胞組（ATM組）和轉(zhuǎn)染同時干擾DNA-PKcs+ATM表達HeLa細胞組（DNA-PKcs+ATM組）的DNA-PKcs和ATM蛋白和mRNA表達水平，檢測沉默效果。
　　3. CCK8檢測對照組、單獨及同時沉默DNA-PKcs、ATM對HeLa細胞增殖活性的影響。
　　4.流式細胞儀檢測對照組、單

6、獨及同時沉默DNA-PKcs、ATM對 HeLa細胞凋亡的影響。
　　5. Transwell小室侵襲模型檢測對照組、單獨及同時沉默DNA-PKcs、ATM對HeLa細胞侵襲能力的影響。
　　6.克隆形成實驗檢測對照組、單獨及同時沉默 DNA-PKcs、ATM對 HeLa細胞放療敏感性的影響。
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料均進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，符合正態(tài)性條件的結(jié)果以均數(shù)±標

7、準差（x±S）表示，各組間比較采用方差分析或者非參數(shù)檢驗，組間兩兩比較用SNK（Student-Newman-Keuls，SNK）法。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系及對沉默效果的檢測：使用含嘌呤霉素的梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，確定嘌呤霉素對HeLa細胞的最佳篩選濃度為0.8ug/ml。然后用此濃度的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的HeLa細胞，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。通

8、過Western Blot和Quantitative Real-time PCR分別從蛋白水平和mRNA水平檢測各組細胞中 DNA-PKcs和ATM量的變化，結(jié)果顯示：DNA-PKcs組和ATM+DNA-PKcs組的DNA-PKcs mRNA和蛋白水平均較其它組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；ATM組和DNA-PKcs+ATM組ATM蛋白和mRNA均較其它組表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)。
　　2.細胞增殖實驗

9、結(jié)果顯示：在24 h、48 h、72 h、96 h四個時間點，ATM+DNA-PKcs組增殖活性較對照組低，差異分別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在48 h、72 h、96 h各個時間點時，ATM+DNA-PKcs組增殖活性較ATM組低，DNA-PKcs組較對照組增殖活性低，差異分別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在72 h、96 h各個時間點時，ATM+DNA-PKcs組較DNA-PKcs組增殖活性低，ATM組較對照組增殖活性低，差異均

10、有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；在96h時，DNA-PKcs組較ATM組增殖活性低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。余差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3.細胞凋亡實驗結(jié)果顯示：ATM+DNA-PKcs組較DNA-PKcs組、ATM組及對照組凋亡增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；DNA-PKcs組較ATM組和對照組凋亡增加，有統(tǒng)計學差異（P<0.05），其余差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　4. Trans

11、well小室侵襲實驗結(jié)果顯示：實驗組較對照組穿過基質(zhì)膠細胞數(shù)少，差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中ATM+DNA-PKcs組的穿過基質(zhì)膠細胞數(shù)最少；ATM+DNA-PKcs組較ATM組和DNA-PKcs組穿過基質(zhì)膠細胞數(shù)少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余則無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　5.放療敏感性實驗結(jié)果顯示：在2，4，6 Gy三個放射線劑量時，實驗組較對照組克隆形成率低，且ATM+DNA-PKcs組較DNA

12、-PKcs組和ATM組克隆形成率低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在6Gy時DNA-PKcs組較ATM組克隆形成率低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；余差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. DNA-PKcs對HeLa細胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響較ATM明顯。
　　2.同時沉默宮頸癌 HeLa細胞 DNA-PKcs和ATM表達較單獨沉默DNA-PKcs或ATM，能更有效的增加HeLa細胞凋