慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾沉默Livin基因?qū)Υ竽c癌Ht-29細(xì)胞祼鼠移植瘤生長及化放療敏感性影響的研究.pdf

1、目的：
　　 本課題體外實驗部分已經(jīng)證實慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾能高效、穩(wěn)定的干擾HT-29細(xì)胞Livin基因的表達(dá)。HT-29細(xì)胞Livin基因抑制后，細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期重新分布，能增強5-Fu、奧沙利鉑和伊立替康的抗腫瘤作用?，F(xiàn)進(jìn)一步通過體內(nèi)實驗探討慢病毒載體介導(dǎo)RNA干擾沉默Livin基因表達(dá)，對大腸癌HT-29細(xì)胞裸鼠移植瘤生長及對放化療敏感性的影響，初步闡明Livin是否可成為大腸癌治療的一個新

2、靶點。
　　 方法：
　　 1.將正常培養(yǎng)的HT-29細(xì)胞(空白對照組)、轉(zhuǎn)染攜帶Livin基因短發(fā)央RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒的HT-29細(xì)胞(實驗組)，以及轉(zhuǎn)染攜帶無關(guān)序列片段shRNA慢病毒的HT-29細(xì)胞(陰性對照組)分別接種于BALB/C(nu/nu)裸鼠，建立皮下移植瘤裸鼠模型，觀察裸鼠體重及瘤體積的變化。第42天處死裸鼠后取下腫瘤組織，RT-PCR分析Livin mRNA

3、表達(dá)的變化，免疫組化分析Livin蛋白表達(dá)的變化，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的變化。
　　 2.將第一代大腸癌HT-29細(xì)胞皮下移植瘤瘤組織塊接種至裸鼠，待長成一定體積后分別瘤內(nèi)注射干擾慢病毒(實驗組)、空載慢病毒(陰性對照組)和生理鹽水(空白對照組)，同時腹腔內(nèi)分別注入5-Fu、奧沙利鉑和伊立替康。具體分為5-Fu、奧沙利鉑和伊立替康實驗組，5-Fu、奧沙利鉑和伊立替康陰性對照組，以及5-Fu、奧沙利鉑和伊立替康空白對照組共9組

4、，挑選15個時間點共觀察70天，每周2次，觀察裸鼠的體重和腫瘤體積，繪制裸鼠體重和移植瘤生長曲線。
　　 3.將第一代大腸癌HT-29細(xì)胞皮下移植瘤瘤組織塊接種至裸鼠，待長成一定體積后分別瘤內(nèi)注射干擾慢病毒(實驗組)、空載慢病毒(陰性對照組)和生理鹽水(空白對照組)，同時均給予6MV X線照射，2Gy/次，連續(xù)5天，總量為10Gy。共挑選24個時間點觀察100天，觀察裸鼠體重和腫瘤體積的變化，繪制體重和腫瘤生長曲線。
　　

5、 4.結(jié)果均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料之間比較采用x2檢驗，腫瘤體積生長采用重復(fù)測量方差分析，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，p<0.01有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.Livin基因RNA干擾慢病毒載體系統(tǒng)的直接抑瘤作用：空白對照組、陰性對照組及實驗組3組細(xì)胞均成瘤，成瘤率為100％。第42天處死裸鼠，3組裸鼠體重之間無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.352，p=0.

6、709)。裸鼠移植瘤體積在各時期之間、分組之間存在總體差異(F=217.178，p<0.001；F=18.103，p<0.001)，各時期與分組之間存在交互作用(F=14.237，p<0.001)。體積抑瘤率為(50.04±0.07)％，瘤體重量明顯減輕(F=4.847，p=0.024)，瘤重抑瘤率達(dá)(50.27±0.17)％。實驗組Livin mRNA表達(dá)水平為(17.75±0.08)％，明顯低于空白對照組(67.60±0.05)％和

7、陰性對照組(68.54±0.03)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=89.971，p<0.001)。實驗組Livin蛋白表達(dá)水平為(36.00±3.40)％，明顯低于空白對照組(85.00±3.15)％和陰性對照組(80.33±3.08)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=107.321，p<0.001)。實驗組沉默Livin基因后組織中細(xì)胞凋亡數(shù)增多，凋亡率為(23.67±2.25)％，明顯高于空白對照組(5±1.50)％和陰性對照組(8.33±1.8

8、2)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.936，p<0.001)。
　　 2.Livin基因RNA干擾慢病毒載體系統(tǒng)聯(lián)合化療藥物的抑瘤作用：裸鼠體重在觀察時間、分組總體之間都存在差異(F=3.086，p=0.002；F=11.739。p<0.001)。腫瘤體積在各時間點之間總體存在顯著差異(F=64.993，p<0.001)，在分組之間總體也存在顯著差異(F=8.610，p<0.001)。5-Fu、奧沙利鉑、伊立替康實驗組腫瘤體積均

9、顯著小于它們的陰性對照組(p=0.001，p=0.049，P=0.001)。
　　 3.Livin基因RNA干擾慢病毒載體系統(tǒng)聯(lián)合放射線的抑瘤作用：裸鼠體重在各觀察時間點、分組之間總體無統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.1015，p=0.330：F=1.022。p=0.383)。腫瘤體積在各時間點、分組之間總體存在顯著差異(F=71.250，p<0.001；F=10.702，P=0.001)，實驗組腫瘤體積顯著小于陰性對照組和空白對照組(p均