RNA干擾對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞PIDD蛋白表達(dá)及藥物敏感性影響的研究.pdf

1、一、背景與目的 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-KB)的活化起著重要作用。已知NF-KB活化與腫瘤形成、血管生成、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、抗凋亡等關(guān)系密切，而在腫瘤耐藥方面，目前的研究資料認(rèn)為NF-KB活化后可上調(diào)腫瘤細(xì)胞存活基因的轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物所引起的死亡效應(yīng)，從而誘導(dǎo)腫瘤耐藥。 在過去的研究中，已揭示了細(xì)胞表面受體誘導(dǎo)NF-kB活化的過程：在未受到刺激的細(xì)胞中，NF-kB與抑制蛋白結(jié)合在一起主要存在于細(xì)胞

2、漿中。受到某些因子的刺激后，細(xì)胞漿內(nèi)的一系列激酶活化從而引起NF-kB的活化，隨即，活化的NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核，激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。但最近的研究資料表明，NF-kB活化的“胞核至胞漿(nuclear-to-plasmic)”通路也許更為重要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)化療藥物可直接引起DNA損傷，其誘導(dǎo)NF-kB活化的始動(dòng)因素正是居于細(xì)胞核內(nèi)。PIDD(p53-induced protein with a deathdomain)在細(xì)胞DNA損傷中介導(dǎo)

3、了NF-KB“胞核至胞漿”通路的活化過程。它是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白分子，主要存在于胞漿內(nèi)，分子量約100kDa，在胞漿中分裂成為含死亡結(jié)構(gòu)域的C末端PIDD-C和富含亮氨酸重復(fù)序列的N末端PIDD-N。目前的研究發(fā)現(xiàn)PIDD-C可進(jìn)入胞核內(nèi)與NEMO(NF-KB essential modulator)和RIP1(receptor-interactingprotein1)形成“胞核PIDD復(fù)合體”，在基因毒性應(yīng)激(genotoxic st

4、ress)條件下，SUMO( small ubiquitin-like modifier)與復(fù)合物中的NEMO(NF-kB essential modulator)結(jié)合，促進(jìn)其發(fā)生磷酸化和泛素化，活化后的NEMO從胞核進(jìn)入胞漿，降解IkB， NF-kB即被活化進(jìn)入胞核，啟動(dòng)存活基因的轉(zhuǎn)錄，從而表現(xiàn)為抗凋亡效應(yīng)。 鑒于PIDD在細(xì)胞抗凋亡的過程中起著重要作用，而既往有關(guān)研究資料又缺乏對(duì)PIDD與結(jié)腸癌細(xì)胞藥物敏感性關(guān)系的探討，本研

5、究重點(diǎn)討論P(yáng)IDD所介導(dǎo)的抗凋亡途徑與HT-29細(xì)胞藥物敏感性變化的關(guān)系，初步明確PIDD對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞藥物敏感性的作用，以進(jìn)一步完善結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的發(fā)生機(jī)制。 二、方法 1.PIDD siRNA的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及檢測(cè)根據(jù)人PIDD的mRNA，應(yīng)用RNAi設(shè)計(jì)軟件，進(jìn)行全基因組掃描和序列同源性分析，設(shè)計(jì)針對(duì)Genbank中PIDD的特異siRNA四對(duì)，同時(shí)設(shè)計(jì)一套序列相同的陰性對(duì)照。將siRNA分別轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞，轉(zhuǎn)染

6、24h、48h、72h用熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。提取細(xì)胞蛋白，并用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。選擇轉(zhuǎn)染效果最佳的siRNA作為轉(zhuǎn)染組，進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。 2.分別用5-Fu處理空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，抽提處理前后共6組細(xì)胞的胞漿及胞核蛋白，Westem blotting檢測(cè)PIDD表達(dá)。3組細(xì)胞處理前后NF-kB活性及凋亡率的變化分別由凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility sh

7、ift assay，EMSA)及流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)。MTT法檢測(cè)3組細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。 三、主要結(jié)果 1.PIDD siRNA的轉(zhuǎn)染效率熒光顯微鏡觀察，各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞組在各時(shí)相點(diǎn)的轉(zhuǎn)染率均大于90％，Westem blotting檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)與其它3種siRNA相比較，PIDD-360的轉(zhuǎn)染效率有升高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)這種抑制效應(yīng)存在一定的時(shí)效關(guān)系，即：轉(zhuǎn)染48h后能檢測(cè)出抑制效應(yīng)，72-96h

8、左右達(dá)到最高峰。 2.Westem blotting結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，PIDD的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組；在空白組對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中PIDD主要分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核少見表達(dá)?？瞻讓?duì)照和對(duì)陰性照給予5-Fu處理后PIDD分布發(fā)生了明顯的變化，遷移至細(xì)胞核中；轉(zhuǎn)染組5-Fu處理后PIDD在胞漿和胞核中的表達(dá)仍未升高。 3.MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組的藥物敏感性明顯降低，與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

9、<0.05)。 4.EMSA檢測(cè)細(xì)胞核蛋白NF-kB的活性未用5-Fu處理的3組HT-29細(xì)胞NF-KB的表達(dá)均為陰性，在用5-Fu刺激后，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組NF-1(B的活性明顯增高，而轉(zhuǎn)染組則仍為陰性。 5.FCM分析三組細(xì)胞的凋亡率接近，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但給予5-Fu處理后，則轉(zhuǎn)染組的凋亡率大大高于其他兩組，差異顯著(P<0.05)。 四、結(jié)論 1.特異性siRNA可減低HT-29