c-myc反義寡核苷酸對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性研究.pdf

1、大腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)，大腸癌發(fā)病率排在惡性腫瘤的第3位。在我國(guó)，隨著生活水平的不斷提高，飲食習(xí)慣的改變，大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)以4．2%的平均速度遞增。目前大腸癌的治療方法以手術(shù)切除為主，輔以化療和放療等綜合治療。大腸癌是一種全身性疾病，雖然腫瘤被完全切除，但是在原發(fā)腫瘤出現(xiàn)明顯癥狀之前，可能已經(jīng)發(fā)生播散性轉(zhuǎn)移，約半數(shù)病例術(shù)后2年出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。20世紀(jì)八十年代末新輔助化療被應(yīng)用于大腸癌，并作為圍手術(shù)期治療的

2、重要輔助手段。新輔助化療的意義在于降低手術(shù)后復(fù)發(fā)、減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、提高切除率和治愈率、延長(zhǎng)生存期、改善術(shù)后生存質(zhì)量，它的積極意義已經(jīng)被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可。但化療最大的障礙是腫瘤細(xì)胞的多耐藥性，特別是大腸癌細(xì)胞的多藥耐藥（MDR）基因原發(fā)性高表達(dá)或繼發(fā)性高表達(dá)，使得大腸癌細(xì)胞的多耐藥性明顯高于其他腫瘤，因此大腸癌的化療效果明顯低于其他腫瘤。 人們對(duì)大腸癌的認(rèn)識(shí)已達(dá)到細(xì)胞分子生物學(xué)水平。大腸癌從遺傳學(xué)和分子生物學(xué)角度認(rèn)識(shí)，是一種基因病，

3、即癌基因的激活和抑癌基因的失活，以及基因表達(dá)調(diào)控失常。大腸癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)是多種基因突變長(zhǎng)期、多階段、多步驟的積累過(guò)程。大腸癌基因治療已成為研究熱點(diǎn)之一并已經(jīng)從基礎(chǔ)理論階段進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。目前大腸癌基因治療基礎(chǔ)研究主要有：①細(xì)胞因子基因治療；②針對(duì)癌基因和抑癌基因的治療；③反義基因治療；④自殺基因治療；⑤多藥耐藥基因治療；⑥抗腫瘤血管形成基因治療；⑦放射基因治療等。 反義寡核苷酸（antisense oligonucleart

4、ides，ASODN）技術(shù)的基本原理是根據(jù)Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律和核酸雜交原理，設(shè)計(jì)出能與靶基因特定區(qū)域結(jié)合的互補(bǔ)反義寡核苷酸片段，與靶基因（DNA）或信使核糖核酸（mRNA）的特定序列相結(jié)合，以影響靶基因的表達(dá)、抑制其功能，而其他基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)則不受影響。反義概念由Zamecnik和Stephenso在1978年首次描述，20多年來(lái)，大量研究證實(shí)了ASODN特異性抑制基因表達(dá)的能力，人們也逐漸認(rèn)識(shí)到其在疾病治療方面

5、的巨大潛能。反義寡核苷酸（ASODN）對(duì)基因表達(dá)的抑制作用可通過(guò)多種不同的機(jī)制而實(shí)現(xiàn)：①抑制基因轉(zhuǎn)錄，即ASODN與DNA雙螺旋分子的特異序列結(jié)合形成三螺旋DNA以阻止基因的轉(zhuǎn)錄；②抑制RNA的加工，主要是抑制mRNA前體的剪接；③抑制RNA的翻譯，如果ASODN序列與目的mRNA翻譯起始序列互補(bǔ)，二者雜交結(jié)合，可阻止mRNA進(jìn)入核糖體，而抑制翻譯的起始；如果ASODN與mRNA起始位點(diǎn)下游序列互補(bǔ)，二者結(jié)合能阻止核糖體在mRNA上的移

6、動(dòng)而終止翻譯的進(jìn)行；④誘導(dǎo)RnaseH（RNA酶H）介導(dǎo)的RNA降解作用，這可能是反義抑制作用的最主要的機(jī)制。RnaseH能裂解DNA-RNA雜化雙鏈中的RNA鏈。當(dāng)ASODN與目的mRNA結(jié)合成雜化雙鏈時(shí)，即可啟動(dòng)RnaseH的裂解功能，將目的mRNA鏈降解，從而抑制基因表達(dá)蛋白的產(chǎn)生。反義治療的優(yōu)點(diǎn)：①反義化合物的靶點(diǎn)是引起腫瘤的癌基因，通過(guò)調(diào)控基因產(chǎn)物的表達(dá)而發(fā)揮治療作用。當(dāng)致病蛋白質(zhì)大量存在時(shí)，針對(duì)蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)藥物難以治療的情況

7、下，反義治療時(shí)一種較為有效的治療方法；②反義化合物可用于治療傳統(tǒng)藥物不能治愈的基因疾?。虎鄯戳x治療比表達(dá)載體基因治療更為安全有效，不良反應(yīng)更少；④用于反義治療的化合物的費(fèi)用可能比傳統(tǒng)藥物更為低廉。反義治療因其具有高特異性和低毒副作用，在腫瘤治療學(xué)研究中頗受重視，研究進(jìn)展極為迅速，經(jīng)不斷完善和改進(jìn)，已逐步進(jìn)入臨床，并顯示出輝煌的應(yīng)用前景。目前已有應(yīng)用ASODN治療一些惡性腫瘤的研究，如慢性淋巴細(xì)胞性白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膀肌癌、多發(fā)骨髓瘤

8、、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、間皮瘤和肺癌等，已經(jīng)取得了一定的療效。 c-myc基因?qū)儆趍yc原癌基因家族，定位于染色體8q24，c-myc基因主要通過(guò)擴(kuò)增和染色體易位重排的方式激活，與某些組織腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演變轉(zhuǎn)歸有重要關(guān)系。c-myc癌基因?qū)俸说鞍谆?，具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，并具有與染色體DNA結(jié)合的特性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。c-myc的表達(dá)活性與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂速度密切相關(guān)，而且也是細(xì)胞凋亡的潛在誘導(dǎo)因子

9、。在不同的人體腫瘤細(xì)胞系中，包括粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞系，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，某些神經(jīng)母細(xì)胞病細(xì)胞系，乳腺癌細(xì)胞系及某些肺癌細(xì)胞系，已發(fā)現(xiàn)c-myc過(guò)度表達(dá)，在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中也觀察到c-myc基因的擴(kuò)增。c-myc基因還參與了腫瘤的血管新生，在腫瘤的生成過(guò)程中，c-myc基因扮演著控制血管生長(zhǎng)作用，而這個(gè)發(fā)現(xiàn)也使得c-myc成為人類對(duì)抗腫瘤的新希望。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有利用c-myc ASODN對(duì)心血管疾病、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌、

10、腎癌等的相關(guān)研究。c-myc ASODN在降低乳腺癌細(xì)胞耐藥性、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞凋亡及抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)等方面都有較好的效果，有研究顯示，c-myc暫時(shí)受抑也足以使腫瘤永久停止生長(zhǎng)。 目前對(duì)大腸癌全身輔助化療的研究非?；钴S，并且取得令人矚目的進(jìn)展。臨床上大腸癌一線化療以鉑類和氟尿嘧啶為主，但耐藥性及副作用大等缺點(diǎn)也限制了其應(yīng)用。聯(lián)合ASODN和傳統(tǒng)化療藥物已成為腫瘤研究中較為常見(jiàn)的策略。近

11、年來(lái)經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究證實(shí)，抗細(xì)胞凋亡因子在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及耐藥性產(chǎn)生中起著重要作用。c-myc是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因，與腫瘤耐藥的形成有密切關(guān)系。ASODN具有增強(qiáng)化療效果的作用，將ASODN與奧沙利鉑等化療藥物同時(shí)應(yīng)用于大腸癌細(xì)胞，這就使兩種抗腫瘤機(jī)制有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)抑制大腸癌細(xì)胞增值和擴(kuò)散，促進(jìn)其凋亡的目的，孫等人的研究表明c-mycASODN可通過(guò)下調(diào)卵巢癌c-myc的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)卵巢癌對(duì)DDP耐藥。Nita等應(yīng)用針對(duì)Bcl-x

12、（L）的ASODN能提高結(jié)腸癌對(duì)5-Fu化療的敏感性。 基于前述國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，在反義核酸技術(shù)日漸成熟的基礎(chǔ)上，本研究擬合成多條c-myc反義寡核苷酸鏈，利用脂質(zhì)體將c-myc的ASODN導(dǎo)入大腸癌HT29細(xì)胞中，抑制或封閉c-myc基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)、增值、分化和誘導(dǎo)其凋亡的目的。同時(shí)因ASODN具有增強(qiáng)化療效果的作用，應(yīng)用針對(duì)c-myc的ASODN，同時(shí)應(yīng)用奧沙利鉑等化療藥物，利用MTT方法檢測(cè)其是否能夠提高

13、結(jié)直腸癌對(duì)奧沙利鉑等化療藥物的敏感性。這種腫瘤治療方法把反義核酸技術(shù)同化療進(jìn)行了完美的結(jié)合，具有極大的臨床研究?jī)r(jià)值。 目的: 人工設(shè)計(jì)并合成c-myc ASODN，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染入大腸癌HT29細(xì)胞，研究體外c-myc ASODN阻斷人大腸癌HT29細(xì)胞中c-myc基因mRNA及蛋白的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖抑制、凋亡及化學(xué)治療敏感性的影響，為大腸癌的基因治療奠定科學(xué)的基礎(chǔ)。 方法: 1．利用脂質(zhì)體Li

14、pofectamineTM2000，將c-myc ASODN轉(zhuǎn)染入大腸癌HT29細(xì)胞中； 2．逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染c-myc ASODN24h后HT29細(xì)胞中c-myc基因mRNA的表達(dá)； 3．Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染c-myc ASODN48h后HT29細(xì)胞中c-myc基因蛋白的表達(dá)； 4．流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)c-myc ASODN對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響；

15、 5．MTT檢測(cè)c-myc ASODN對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖抑制及其對(duì)奧沙利鉑敏感性影響。 結(jié)論: 1．體外c-myc ASODN可抑制c-myc mRNA及蛋白的表達(dá)； 2．阻斷c-myc基因表達(dá)可抑制HT29細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)HT29細(xì)胞凋亡； 3．聯(lián)合應(yīng)用c-myc ASODN和奧沙利鉑可逆轉(zhuǎn)HT29細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性，增強(qiáng)其對(duì)奧沙利鉑的敏感性； 4．反義核酸技術(shù)具有極大的試驗(yàn)研