鹽酸普魯卡因?qū)θ私Y(jié)腸癌HT-29細(xì)胞Syk基因甲基化及表達(dá)的影響.pdf

1、目的:DNA甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的一種重要的表觀遺傳學(xué)過程,人類腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展與抑癌基因的DNA甲基化異常有密切關(guān)系。研究表明DNA甲基化是一種可逆的過程,因此通過去甲基化藥物消除基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài),可使沉默的腫瘤抑癌基因重新表達(dá),從而恢復(fù)其正常功能,達(dá)到治療腫瘤的目的?，F(xiàn)在利用藥物對腫瘤進(jìn)行去甲基化的研究主要集中在2個方面,一類是核苷類似物,如5-Aza-2'-d eo- xycytidin等;一類是非核苷類似物,如普魯卡因

2、等。前者是目前已知很強的甲基化酶抑制劑,但在臨床試驗中核苷類似物已經(jīng)證實有強的毒副作用,限制了其在臨床中的應(yīng)用。因此尋找新的、有潛在效用的去甲基化新藥成為當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點領(lǐng)域。本課題組在前人研究的基礎(chǔ)上,探討鹽酸普魯卡因(procaine, PCA)對人結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞 Syk基因甲基化及表達(dá)的影響,分析藥物處理前后 Syk基因甲基化狀態(tài)和表達(dá)的關(guān)系,并探討 PCA抑制人結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞增殖的分子機制,以期為人結(jié)腸癌的發(fā)

3、病遺傳學(xué)機制及治療提供新的思路并找到新的理論依據(jù)。
　　方法:在本次研究中,我們成功構(gòu)建體外甲基化 DNA(IVD)和非甲基化(NL)的陽性對照,采用巢式雙重甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation- specific PCR, MSP)檢測 HT-29細(xì)胞中Syk基因甲基化狀況;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)( RT-PCR)檢測HT-29細(xì)胞內(nèi) Syk基因表達(dá)情況。應(yīng)用不同濃度(0-10mmol/L)PCA處理人結(jié)腸癌HT-29

4、細(xì)胞,采用MSP檢測 PCA處理前后 HT-29細(xì)胞中Syk基因啟動子的甲基化水平,RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)(WB)觀察藥物處理后 HT-29細(xì)胞內(nèi) Syk基因表達(dá)情況。通過倒置顯微鏡觀察藥物處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀察細(xì)胞周期變化情況。
　　結(jié)果:1、MSP發(fā)現(xiàn)在引物覆蓋的區(qū)域中,HT-29細(xì)胞 Syk基因啟動子存在甲基化,RT-PCR顯示在 HT-29細(xì)胞中S

5、yk基因低表達(dá),表明 HT-29細(xì)胞中Syk基因啟動子甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)沉默的一種機制。2、 MSP檢測證實經(jīng) PCA處理能夠使 HT-29細(xì)胞中Syk基因甲基化水平下降;RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)結(jié)果顯示 Syk基因經(jīng) PCA處理后在人結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。3、通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) PCA處理后的HT-29細(xì)胞呈現(xiàn)縮小、皺縮、空泡、脫壁等增殖變慢的形態(tài)學(xué)特征;MTT結(jié)果分析表明 PCA能顯著抑制HT-29細(xì)胞增殖,其

6、抑制率呈藥物濃度及時間依賴性;FCM結(jié)果顯示 PCA可以使 HT-29細(xì)胞的G0/G1延長,S期縮短。
　　結(jié)論:人結(jié)腸癌 HT-29細(xì)胞中Syk基因啟動子甲基化導(dǎo)致基因失表達(dá)可能是結(jié)腸癌發(fā)病的機制之一;PCA能逆轉(zhuǎn) Syk基因啟動子區(qū)域 CpG島甲基化,并使 Syk基因活化并表達(dá)上調(diào);同時 PCA能夠使 HT-29細(xì)胞的生長阻滯在 G0/G1期,從而顯著抑制HT-29細(xì)胞的增殖。因此我們的研究支持,PCA是一種建立在表觀遺傳學(xué)基