慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默RhoA基因?qū)θ寺殉舶┞闶笠浦擦錾L(zhǎng)的影響及基因治療研究.pdf

1、研究背景:
　　侵襲和遷移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要特征，大約90％的患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌死亡率位居首位。因其臨床癥狀隱匿，診斷時(shí)75％的患者已屬晚期，雖然超過(guò)80%的患者經(jīng)一線治療受益,但Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者的5年生存率徘徊在25%-30%。因此，深入了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并尋求新的治療方法刻不容緩。目前基因治療為卵巢癌的治療提供了新的希望。近年來(lái)興起的RNA干擾技術(shù)因具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用，

2、由于其高效性和特異性在基礎(chǔ)研究方面展現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，然而如何將其優(yōu)勢(shì)發(fā)揮到臨床靶向治療卻是一個(gè)難題。
　　RhoA基因是Rho家族成員之一，作為惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的“開(kāi)關(guān)”基因，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。RhoA基因激活可以導(dǎo)致細(xì)胞癌變，且RhoA信號(hào)通路在參與調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)和增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡及腫瘤新生血管形成等方面發(fā)揮重要作用。因此，以RhoA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的基因治療將有望成為卵巢癌靶向治療的一個(gè)新方向。
　　本研

3、究組在前期研究中，已利用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建了針對(duì)RhoA基因的慢病毒干擾載體并建立了卵巢癌穩(wěn)定沉默RhoA基因細(xì)胞株，且體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)慢病毒介導(dǎo)RNAi下調(diào)RhoA基因表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力。由于體外實(shí)驗(yàn)并不能完全真實(shí)的評(píng)價(jià)對(duì)于卵巢癌干預(yù)措施的可行性和有效性，而建立合適的裸鼠移植瘤模型對(duì)于模擬卵巢癌的病理狀態(tài)并評(píng)價(jià)治療措施是必須的，且有著非常重要的作用。故本研究在此基礎(chǔ)上，建立卵巢癌裸鼠移植瘤模型，首先探討RhoA基

4、因沉默對(duì)卵巢癌裸鼠腹腔侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的影響；其次采用慢病毒介導(dǎo) RhoA shRNA對(duì)其卵巢癌裸鼠皮下移植瘤進(jìn)行抗癌治療的研究，以探討其可行性、有效性及抗腫瘤機(jī)制。
　　第一部分 RhoA基因沉默抑制卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤惡性生物學(xué)行為的研究
　　目的: 構(gòu)建卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，研究慢病毒介導(dǎo)RhoA基因沉默對(duì)人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　1. SP

5、F級(jí)雌性BALB/C裸鼠21只應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組,利用已建立的穩(wěn)定沉默RhoA的HO8910-RhoA-shRNA細(xì)胞，陰性對(duì)照組HO8910-RhoA-NC細(xì)胞，和空白對(duì)照組HO8910細(xì)胞這3組細(xì)胞分別建立裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤模型。
　　2.每2天測(cè)量腹圍，4周后解剖裸鼠。大體觀察：測(cè)定腹水量；統(tǒng)計(jì)腫瘤播散器官數(shù)及瘤結(jié)節(jié)數(shù)；稱量瘤體重量，并計(jì)算抑瘤率。
　　3.鏡下觀察：應(yīng)用HE染色分析移植瘤病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

6、>　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)移植瘤RhoA mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　5.脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的核苷酸缺口末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)檢測(cè)移植瘤凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。
　　結(jié)果:
　　1.HO8910-RhoA-NC組和HO8910組的裸鼠成瘤率均為100%，而穩(wěn)定沉默RhoA基因的HO8910-RhoA-shRNA組裸鼠成瘤率僅為71.4%,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義(P=0.231)。
　　2.與陰性對(duì)照HO8910-RhoA-NC組和空白對(duì)照HO8910組比較，RhoA基因穩(wěn)定沉默HO8910-RhoA-shRNA組裸鼠腹圍增長(zhǎng)明顯滯后（P<0.05）；腹水量明顯減少（P=0.01），腫瘤播散器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)及瘤體重量均明顯減少（P<0.001），抑瘤率達(dá)70.62%；
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照HO8910-RhoA-NC組和空白

8、對(duì)照HO8910組比較， HO8910-RhoA-shRNA組移植瘤RhoA基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P<0.001）；
　　4. TUNEL結(jié)果提示，與陰性對(duì)照HO8910-RhoA-NC組和空白對(duì)照HO8910組比較， HO8910-RhoA-shRNA組移植瘤AI明顯升高（P<0.001）。
　　結(jié)論:
　　卵巢癌細(xì)胞HO8910在腹腔內(nèi)的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移均受到RhoA的影響，慢病毒介導(dǎo)RhoA基因穩(wěn)

9、定沉默時(shí)，裸鼠腹腔移植瘤的重量、數(shù)量及播散轉(zhuǎn)移均相應(yīng)減少，一定程度上延緩了卵巢癌的惡性生物學(xué)行為。
　　第二部分靶向RhoA基因的shRNA對(duì)卵巢癌裸鼠皮下移植瘤治療的研究及其作用機(jī)制探討
　　目的: 探討靶向RhoA基因的shRNA對(duì)卵巢癌裸鼠移植瘤的影響及可能的抗腫瘤作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用細(xì)胞接種法將人卵巢癌細(xì)胞HO8910接種于18只雌性BALB/C裸鼠右前肢腋下建立裸鼠腋下移植瘤模型。荷瘤裸

10、鼠模型建成后，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，即實(shí)驗(yàn)組（予攜帶靶向RhoA基因的shRNA慢病毒液治療）、陰性對(duì)照組(予攜帶針對(duì)隨機(jī)無(wú)關(guān)序列的shRNA慢病毒液治療)、空白對(duì)照組（予磷酸鹽緩沖液），分別于治療開(kāi)始第1，5，9,13天進(jìn)行注射，比較3組裸鼠的移植瘤生長(zhǎng)情況，包括移植瘤生長(zhǎng)速度、腫瘤體積，并繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。治療結(jié)束10d后處死裸鼠，剝離腫瘤，稱腫瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率，同時(shí)留取各組裸鼠腹腔主要臟器。
　　2.應(yīng)用

11、HE染色，鏡下觀察3組移植瘤組織病理形態(tài)學(xué)特征，并判斷裸鼠腹腔臟器有無(wú)轉(zhuǎn)移及慢病毒液的毒性反應(yīng)。
　　3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、免疫組化SP法和蛋白印跡法檢測(cè)移植瘤組織中RhoA mRNA和蛋白的表達(dá)；
　　4. TUNEL法檢測(cè)3組裸鼠移植瘤細(xì)胞的凋亡情況[以凋亡指數(shù)（AI）表示]。
　　結(jié)果:
　　1.自治療開(kāi)始的第9天起，實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)速度滯后于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=

12、0.000)。治療結(jié)束后10 d，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的移植瘤體積為(338±114) mm3，小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組[分別為（1190±332）和（1101±396）mm3]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.000、0.001)；實(shí)驗(yàn)組裸鼠平均腫瘤質(zhì)量為（0.23±0.11）g，低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組[分別為（0.79±0.19）、（0.74±0.17）g]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。而陰性對(duì)照組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)速度、移植瘤

13、體積、平均腫瘤質(zhì)量分別與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞呈大片壞死區(qū)域且核固縮多見(jiàn)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯變化。此外，觀察發(fā)現(xiàn)三組裸鼠腹腔肝、脾、肺及腎組織HE染色結(jié)果顯示形態(tài)正常，且均未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　3.實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤組織中，RhoA mRNA的表達(dá)水平為(0.30±0.05)，低于陰性對(duì)照組的(0.95±0.06)和空白對(duì)

14、照組的(1.00±0.11)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；RhoA蛋白的表達(dá)水平為(0.14±0.06)，低于陰性對(duì)照組的(0.78±0.14)和空白對(duì)照組的(0.75±0.13)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；而陰性對(duì)照組裸鼠移植瘤組織中RhoA mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤組織AI為（20.9±3.4）%，高于陰性對(duì)照組的（5.2

15、±2.0）%和空白對(duì)照組的（6.0±2.1）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。而陰性對(duì)照組裸鼠移植瘤組織中AI與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)慢病毒介導(dǎo)靶向沉默RhoA的基因治療有效下調(diào)卵巢癌裸鼠皮下移植瘤組織中RhoA基因的表達(dá)，抑制了卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，裸鼠動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明RhoA基因沉默治療有效。
　　2.慢病毒介導(dǎo)靶向沉默RhoA基因抑制卵巢癌生長(zhǎng)