VEGF-A-siRNA和CXCR4-siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及對卵巢癌的基因治療.pdf

1、目的：構(gòu)建針對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和趨化因子受體4（CXCR4）慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾載體，通過體外實驗和體內(nèi)實驗觀察卵巢癌細胞VEGF和CXCR4表達受抑制后對癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移情況的影響，部分闡明VEGF/CXCR4基因表達被抑制后對卵巢癌的發(fā)生與進展的影響，為針對VEGF/CXCR4基因的RNA干擾技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：（1）將VEGF基因mRNA和CXCR4基因mRNA作為RNA干擾的靶區(qū)，通過E-R

2、NAi網(wǎng)上提供的在線服務(wù)，設(shè)計多個特異的RNA干擾序列，將其裝入含U6和H1啟動子的慢病毒載體FIV-based Lentivector Expression System上，構(gòu)建成抑制VEGF和CXCR4基因表達的RNA干擾（siRNA）表達載體。（2）體外實驗中，將上述載體轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞株sw626，通過Real time PCR和Western blot觀察干擾載體對VEGF和CXCR4表達的抑制效果；通過CCK8檢測對腫瘤細胞

3、增殖的影響；通過重建基底膜實驗檢測細胞體外侵襲能力的變化。（3）體內(nèi)實驗中，將上述載體轉(zhuǎn)染細胞后注射裸鼠建立卵巢癌模型；通過檢測成瘤率、成瘤時間、瘤體大小、繪制生長曲線，觀察靶基因表達受抑制后，腫瘤增長的變化。腫瘤組織通過檢測CD34表達對MVD進行比較，同時采用TUNEL檢測腫瘤組織凋亡的變化。 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了抗VEGF和CXCR4的siRNA慢病毒表達載體系統(tǒng)，測序證實序列正確。（2）體外實驗中，通過Real tim

4、e PCR和Western blot，在人卵巢癌細胞株sw626中，VEGF和CXCR4慢病毒表達載體能明顯抑制靶基因的表達；CCK8顯示，當(dāng)VEGF受抑制后，腫瘤細胞增殖受抑；重建基底膜實驗證實CXCR4表達受抑后細胞體外侵襲能力顯著降低。（3）體內(nèi)實驗中，VEGF和CXCR4被抑制后可減緩瘤體增長，腫瘤組織MVD下降，細胞凋亡增加。 結(jié)論：（1）針對VEGF和CXCR4基因的siRNA慢病毒表達載體能夠顯著抑制靶基因的表達（