靶向S1P2基因的siRNA有效片段的慢病毒載體篩選.pdf

1、目的：篩選出能顯著抑制原代培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR)陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇受體2（sphingosine-1-phosphate receptor2,S1P2）基因表達(dá)的siRNA慢病毒載體,觀察S1P2基因沉默后對RhoA/Rho激酶信號通路的影響。
　　方法：SHR及SD大鼠各5只采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞并采用差速貼壁法

2、純化，將純化后的細(xì)胞隨機(jī)分成6組，每組5個(gè)樣本，每組每個(gè)樣本1.0×105個(gè)細(xì)胞，分別為: A組、B組、C組(分別攜帶靶向S1P2基因的siRNA-1、2、3號靶點(diǎn)的SHR慢病毒轉(zhuǎn)染組)、D組(攜帶慢病毒空載體SHR轉(zhuǎn)染組)、E組(SHR未轉(zhuǎn)染病毒對照組)、F組(SD大鼠對照組)。將靶向S1P2的siRNA-1、2、3號片段的慢病毒載體及攜帶慢病毒的空載體，以感染復(fù)(MOI)=60分別轉(zhuǎn)染A組、B組、C組、D組SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞

3、，轉(zhuǎn)染72 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況，用 Western印跡分析 S1P2、ROCK1、ROCK2、eNOS在各組陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化，RT-PCR檢測各組陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中S1P2、ROCK1、ROCK2的mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察A組、B組、C組、D組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均＞80％；與E組mRNA、蛋白表達(dá)[S1P2（0.874±0.047）、（0.690±0.122）；ROCK1

4、（0.819±0.055）、（0.731±0.134）；ROCK2（0.854±0.098）、（0.852±0.128）]相比D組[S1P2（0.905±0.091）、（0.701±0.155）；ROCK1（0.871±0.073）、（0.774±0.135）；ROCK2（0.857±0.131）、（0.825±0.115）]均無明顯差距， A組[S1P2（0.560±0.169）、（0.238±0.027）；ROCK1（0.630±0

5、.059）、（0.421±0.160）；ROCK2（0.614±0.127）、（0.486±0.189）]、B組[S1P2（0.731±0.126）、（0.501±0.056）、ROCK1（0.726±0.057）、（0.567±0.134）、ROCK2（0.724±0.146）、（0.652±0.119）]、C組[S1P2（0.624±0.008）、（0.431±0.083）；ROCK1（0.702±0.051）、（0.568±0.1

6、17）；ROCK2（0.649±0.166）、（0.600±0.102）]、F組[S1P2（0.540±0.167）、（0.147±0.046）；ROCK1（0.511±0.152）、（0.291±0.107）；ROCK2（0.568±0.068）、（0.474±0.207）]均顯著低于E組（P<0.05）。而eNOS蛋白表達(dá)，A組（0.495±0.156）、B組（0.535±0.098）、C組eNOS（0.536±0.112）、D組（

7、0.551±0.165）與E組（0.518±0.155）相比均無顯著差別，但F組（0.888±0.069）顯著高于E組。
　　結(jié)論：SHR的陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中S1P2基因表達(dá)上調(diào)，激活RhoA/Rho激酶信號通路。針對大鼠S1P2基因設(shè)計(jì)的三組siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染至SHR大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞后均能顯著抑制SHR陰莖海綿體平滑肌內(nèi)S1P2的表達(dá)，下調(diào)ROCK1、ROCK2表達(dá)，其中靶向S1P2基因的siRNA-1的抑制效