靶向大鼠OPN基因的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：
　　 通過構(gòu)建靶向大鼠骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）基因的RNAi載體，并轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，檢測(cè)并鑒定OPN基因RNAi表達(dá)載體在血管平滑肌細(xì)胞中介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)，為后續(xù)研究提供有力的工具，為實(shí)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后橋血管再狹窄的基因治療提供新的手段。
　　 方法：
　　 1.采用組織貼塊法進(jìn)行大鼠胸腹主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，胰酶消化法傳代，液氮凍存，并應(yīng)用倒置相差顯微鏡

2、和SP法免疫組化染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　 2.通過在Gene Bank中檢索的大鼠骨橋蛋白的mRNA序列，依據(jù)相關(guān)原則，設(shè)計(jì)表達(dá)OPN基因siRNA片斷的基因序列，化學(xué)合成DNA寡核苷酸，經(jīng)過退火、酶切、連接、擴(kuò)增等方法構(gòu)建表達(dá)OPN基因siRNA片斷的質(zhì)粒載體。并通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.設(shè)計(jì)并合成能轉(zhuǎn)錄OPN基因RNAi片斷的DNA序列，進(jìn)而通過穿梭質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)、病毒包裝等步驟完成靶巴向

3、大鼠OPN基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。進(jìn)一步通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果：
　　 1.血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)顯示，85％的組織塊接種存活，顯微鏡下細(xì)胞呈典型的“谷峰狀”生長，SP法免疫組化染色鑒定顯示胞漿內(nèi)α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)陽性。
　　 2.大鼠OPN基因特異性RNAi質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，但其對(duì)離體C6細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不足10％。
　　 3.靶向大鼠OPN基因的RNAi

4、慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70％。
　　 結(jié)論：
　　 1.應(yīng)用組織貼塊法簡便易行，短期內(nèi)可獲得大量符合后續(xù)試驗(yàn)要求的血管平滑肌細(xì)胞。
　　 2.利用pMDTM19-T vector可成功構(gòu)建出符合所設(shè)計(jì)的目的基因的RNAi質(zhì)粒表達(dá)載體，但細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠OPN基因特異性RNAi質(zhì)粒表達(dá)載體對(duì)離體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低下，無法用做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的有效RNAi表達(dá)載體。
　　 3.