大鼠Trail基因慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)用PCR法擴(kuò)增出的Trail基因引入慢病毒載體系統(tǒng),生產(chǎn)Trail慢病毒顆粒并進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)。方法：1.Trail基因的獲得:根據(jù)GenBank中大鼠Trail基因序列(NM145681.1),設(shè)計(jì)出該基因的特異性引物Trail-Agel-F和Trail-Agel-R，并且使用Agel酶的切位點(diǎn)。用PCR法從大鼠cDNA文庫中擴(kuò)增出目的基因。2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建：采用In-Fusion技術(shù)，將酶切回收后的PCR產(chǎn)物線性交換連

2、接入Agel酶切的真核表達(dá)載(GV218),產(chǎn)生目的重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增目的重組質(zhì)粒。3.連接產(chǎn)物的酶切鑒定：收集擴(kuò)增后的連接產(chǎn)物,酶切后經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)得到片段長(zhǎng)度均與預(yù)期相符,基因測(cè)序結(jié)果亦正確,從而證明克隆Trail基因已成功。4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞:用脂質(zhì)體 Lipofeetamine2000包裹構(gòu)建的重組質(zhì)粒和輔助包裝載體,三質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,產(chǎn)生含有表達(dá)Trail蛋白的Lenti

3、virus病毒顆粒。5.病毒檢測(cè):重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá),行Western blot鑒定及使用Real-time定量PCR法檢測(cè)病毒滴度。結(jié)果：成功得到Trail目的基因,重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與GenBank中Trail基因序列(NM145681.1)比較，證實(shí)Trail基因序列正確;三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察到綠色熒光;Western Blot檢測(cè)觀察到58 KD附近處有特征條帶,其大小和目的基