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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建小鼠CX3CR1基因的慢病毒過表達載體。
方法:采用Oligo核酸軟件對Genbank上發(fā)表的小鼠cx3cr1 mRNA序列進行分析，設(shè)計一對分別含有AgeⅠ、BamHⅠ酶切位點的CX3CR1基因上下游引物，PCR擴增出該基因的全序列cDNA，將其定向克隆入pUbi-MSC-EGFP多克隆位點，構(gòu)建pUbi-MSC-CX3CR1-EGFP慢病毒表達載體。再通過氨芐青霉素抗性篩選、陽性轉(zhuǎn)化子PCR鑒定，選取正確的克隆進
2、行測序鑒定。重組慢病毒載體構(gòu)建成功后，應(yīng)用慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper1.0，pHelper2.0及Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293T細胞獲得病毒液，通過RT-PCR檢測細胞中EGFP表達水平變化并計算病毒滴度。
結(jié)果:PCR及測序結(jié)果表明目的基因序列克隆正確，成功構(gòu)建了含有小鼠CX3CR1基因的重組表達載體，并包裝成為慢病毒，獲得滴度為2×108TU/ml的病毒液。
結(jié)論:本課題成功構(gòu)建慢病毒過表達載
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