大鼠FasL基因重組慢病毒載體介導(dǎo)大鼠腎臟轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝合成大鼠FasL基因重組慢病毒載體并用慢病毒載體體內(nèi)、外轉(zhuǎn)染大鼠腎細(xì)胞，研究轉(zhuǎn)染后：FasL的表達(dá)。為進(jìn)一步進(jìn)行同種異體腎移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、研究FasL基因轉(zhuǎn)染在同種異體移植中誘導(dǎo)免疫耐受的作用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293-T包裝細(xì)胞，收集上清并用P24gag ELISA試劑盒對(duì)其定量。 2.原代培養(yǎng)大鼠腎細(xì)胞，F(xiàn)CM測(cè)定其Fas、FasL的表達(dá)。 3.分別用空白慢病毒

2、載體及FasL，慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)大鼠腎細(xì)胞，RT-PCR、Western-blot鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。 4.分別用空白慢病毒載體及FasL慢病毒載體經(jīng)腎動(dòng)脈體內(nèi)轉(zhuǎn)染，于3天、7天、15天、25天、40天取腎標(biāo)本，切片后分別用HE、IHC染色，觀察有無(wú)腎細(xì)胞形態(tài)改變、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá)結(jié)果。 結(jié)果： 1.三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293-T包裝細(xì)胞合成慢病毒載體，P24gag ELISA法對(duì)其定量，空白慢病毒

3、載體及FasL慢病毒載體體濃度分別為13.8ng/ml、11.6ng/ml。 2.FCM測(cè)定大鼠原代培養(yǎng)腎細(xì)胞Fas、FasL的表達(dá)分別為3.36％、2.47％。 3.慢病毒載體體外轉(zhuǎn)染大鼠腎細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果顯示目的基因載體在870bp有明顯條帶，而空白慢病毒載體未見(jiàn)明確條帶，Western-blot鑒定目的基因載體有明顯顯色條帶，而空白慢病毒載體未見(jiàn)顯色。 4.慢病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染腎臟，目的基因

4、載體各時(shí)段樣本HE染色未見(jiàn)腎細(xì)胞形態(tài)改變及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與空白組比較無(wú)明顯差異。IHC 染色目的基因載體轉(zhuǎn)染后15天出現(xiàn)表達(dá)高峰，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理15天、25天組與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，其它時(shí)段染色較空白組深，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： 1．成功合成FasL慢病毒載體并用P24gag ELISA對(duì)其定量。 2．大鼠腎細(xì)胞低表達(dá)Fas、FasL，適用于轉(zhuǎn)FasL研究