大鼠CKIα的原核表達(dá)、純化和攜帶大鼠CKIα基因慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染鼠BMSCs的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟疾病嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有140萬人死于由肝炎、感染、腫瘤等慢性肝臟疾病引起的晚期終末肝功能衰竭。原位肝移植（Orthotopic Liver Transplantation，OLT）是目前治療肝衰竭最主要的治療手段，但由于肝源短缺，費(fèi)用高昂等問題，使得肝移植惠及的人群非常有限，難以廣泛開展。近年來，生物人工肝(Bioartificial Liver，BAL)和肝細(xì)胞移植(Liver cellTransplanta

2、tion，LCT)開始作為肝移植的輔助或替代療法而日益受到人們的關(guān)注。然而，細(xì)胞來源不足一直是兩者發(fā)展及應(yīng)用的一大瓶頸。20世紀(jì)90年代以來興起的干細(xì)胞技術(shù)日漸成熟，成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。以干細(xì)胞移植為主的細(xì)胞療法作為一種新興的手段，為解決種子細(xì)胞來源和肝臟疾病的治療提供了新的思路和方法。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是一類具有自我復(fù)制功能和分化

3、潛能的早期未分化細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞的一種，具有很強(qiáng)的可塑性，可以跨越胚層橫向分化為肝樣細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，且具備取材方便、體外培養(yǎng)技術(shù)成熟以及自體移植等優(yōu)點(diǎn)，因此其有望成為組織工程和細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。如何高效誘導(dǎo)BMSCs向肝樣細(xì)胞分化，是干細(xì)胞移植等肝病治療的關(guān)鍵，但由于其具體的分化機(jī)制尚未明確，這一關(guān)鍵問題尚未得到滿意解決，臨床應(yīng)用也遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期效果。因此探究BMSCs向肝樣細(xì)胞分化的分子機(jī)制意義重大。
　　 BMS

4、Cs向肝樣細(xì)胞分化的事實(shí)已經(jīng)得到了多數(shù)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，但其具體的分化機(jī)制尚存在爭議。目前主要觀點(diǎn)有:①橫向分化學(xué)說:BMSCs本身具有多向分化潛能，可以分化為肝樣細(xì)胞;②細(xì)胞融合學(xué)說:BMSCs首先與宿主肝細(xì)胞融合，然后進(jìn)一步分化為肝樣細(xì)胞。由于許多干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合的現(xiàn)象，故目前多數(shù)學(xué)者更支持橫向分化學(xué)說，然而BMSCs橫向分化的具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。
　　 由于微環(huán)境是干細(xì)胞賴以生存的“土壤”，因此眾多研究人員將其作

5、為干細(xì)胞定向分化機(jī)制研究的切入點(diǎn)。細(xì)胞局部的微環(huán)境包括細(xì)胞周圍多種細(xì)胞因子、激素、基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等。細(xì)胞因子的作用尤為重要，在不同的細(xì)胞因子作用下BMSCs可分化為不同的細(xì)胞類型。微環(huán)境中的各種因子的表現(xiàn)類型、濃度和作用次序是影響B(tài)MSCs分化的重要因素。不同時(shí)期、不同部位、不同狀態(tài)下微環(huán)境的組成及結(jié)構(gòu)不同，對干細(xì)胞的影響也不同。正常情況下，微環(huán)境保護(hù)干細(xì)胞不被清除，維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，同時(shí)抑制其過度增殖;當(dāng)機(jī)體受到損害時(shí)，微

6、環(huán)境發(fā)生相應(yīng)改變，通過一定的信號通路傳遞，有選擇地激活或抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)相關(guān)基因，從而出現(xiàn)特定的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控，進(jìn)而使干細(xì)胞向特定成體細(xì)胞分化。
　　 基于以上觀點(diǎn)，我們提出肝衰竭的肝內(nèi)微環(huán)境中存在著某些有別于生理狀態(tài)下的生物因子，這些因子能夠刺激BMSCs向肝樣細(xì)胞分化。為了探尋究竟是何種生物因子在發(fā)揮誘導(dǎo)作用，我們課題組在前期利用蛋白組學(xué)技術(shù)對比肝衰竭大鼠和健康大鼠肝臟，篩選出27個(gè)有顯著差異的蛋白位點(diǎn)，通過生物信

7、息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)其中的酪蛋白激酶Iα（上調(diào)）、T盒轉(zhuǎn)錄因子（上調(diào)）和酪氨酸蛋白激酶（下調(diào)）與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)。
　　 酪蛋白激酶Iα(Casein kinase Iα，CKIα)是一類具有獨(dú)特理化特性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于真核生物中，且分布廣泛，主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等部位。具有組成型活力（即被分離或者原核表達(dá)的CKIα都具有活性）。CKIα可磷酸化底物蛋白質(zhì)中已被磷酸化的位點(diǎn)，也可作為其它蛋白激酶的底物

8、被磷酸化，參與蛋白質(zhì)的級聯(lián)磷酸化過程，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，進(jìn)而參與包括基因表達(dá)、細(xì)胞增殖及分化等多種細(xì)胞調(diào)節(jié)過程。研究已經(jīng)證實(shí)CKIα主要參與Wnt和Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而該兩條信號通路與干細(xì)胞的分化和增殖密切相關(guān)。
　　 肝衰竭微環(huán)境中CKIα明顯上調(diào)，這些CKIα來自于何處:是受損的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的，還是微環(huán)境的變化刺激干細(xì)胞分泌的？尚不清楚。而上調(diào)的CKIα能促進(jìn)BMSC肝樣分化是外源性的CKIα直接刺激BMSCs，還是微

9、環(huán)境中某些因素誘導(dǎo)BMSCs自身過表達(dá)CKIα，繼而這些內(nèi)源性表達(dá)的CKIα促進(jìn)BMSCs分化呢？這些問題也是我們課題組一直欲研究探討的。因此，本研究中的第一部分?jǐn)M采用分子生物學(xué)技術(shù)，利用原核表達(dá)體系從大腸桿菌中表達(dá)出重組CKIα，并擬用Ni柱親和層析使其得以高效純化，為下一步我們進(jìn)行CKIα與BMSCs共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究做前期準(zhǔn)備，也為我們進(jìn)一步探討CKIα的生物學(xué)功能和研究它在BMSCs向肝樣細(xì)胞分化過程中的作用奠定基礎(chǔ)。本研究的第二部

10、分我們擬通過Gateway技術(shù)構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)CKIα基因的慢病毒載體，再通過轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，獲得CKIα過表達(dá)的BMSCs模型，從而為下一步可誘導(dǎo)表達(dá)CKIα的鼠BMSCs肝向分化的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 第一章大鼠CKIα的原核表達(dá)及純化
　　 目的:構(gòu)建大鼠CKIα表達(dá)質(zhì)粒，采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組CKIα并將其純化，獲得濃度高、純度好的重組CKIα。
　　 方法:RNA提取試劑盒分離、純

11、化大鼠肝細(xì)胞總RNA。然后再以RNA為模板，以隨機(jī)六聚體核苷酸為引物，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA的第一鏈。根據(jù)GenBank報(bào)道的大鼠CKIα的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增大鼠CKIα基因的兩對引物，分別在內(nèi)側(cè)上下游引物5'端加上限制性酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI。以RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA為模板，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增CKIα基因。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，將其插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-1

12、6b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-16b-CKIα，經(jīng)酶切和DNA測序鑒定后，將pET-16b-CKIα轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stb(1)3感受態(tài)細(xì)菌。再將工程菌以1∶100接種于含有葡萄糖和甘油的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值約0.5-1.0，之后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。4℃離心收集細(xì)菌，洗滌，超聲破碎。1200r/min離心洗滌，分離包涵體。沉淀用含0.5％的Triton洗滌3次，純化包涵體。用8M尿素溶解包涵體，然后用凝膠過濾純化目的蛋白，并用Wes

13、tern blotting對重組CKIα樣品進(jìn)行分析鑒定。
　　 結(jié)果:1、經(jīng)核苷酸序列測定和NdeI/BamHI雙酶切鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-16b-CKIα;2、經(jīng)Ni-NTA柱親和純化后的重組CKIα經(jīng)Westernblotting檢測，在30 kDa和40 kDa之間可見明顯增濃的大小約為38 kDa的蛋白條帶，并在膠片上有相應(yīng)的曝光條帶，與預(yù)期大小相符。
　　 結(jié)論:1、成功構(gòu)建了pET-16b

14、-CKIα原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后表達(dá)出CKIα的重組蛋白;2、初步摸索優(yōu)化了重組大鼠CKIα的表達(dá)條件，包含體提取步驟，初步純化工藝;3、成功克隆了大鼠CKIα基因，序列分析和文獻(xiàn)報(bào)道一致;4、純化獲得重組CKIα，為進(jìn)一步蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定和探討其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的肝向分化中的作用研究奠定了一定基礎(chǔ)。
　　 第二章攜帶大鼠CKIα基因慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染鼠BMSCs的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:構(gòu)建可誘導(dǎo)表

15、達(dá)CKIα基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293FT細(xì)胞獲得相應(yīng)的病毒顆粒，感染并獲得在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)條件下穩(wěn)定、高效表達(dá)CKIα的BMSCs，為下一步可誘導(dǎo)表達(dá)CKIα的鼠BMSCs肝向分化的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:以pcDNA-CKIα為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增前后端帶有attB重組位點(diǎn)的CKIα全長序列。利用Gateway載體構(gòu)建技術(shù)，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過BP反應(yīng)克隆至pDown載體中，測序正確后，采用L

16、R重組酶將pDown-CKIα，pUP-EF1A和pLV.Des3d.p/neo進(jìn)行重組反應(yīng)，構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒pLV.Des3d.P/neo-EF1 A-CKIα-IRES/eGFP。然后將pLV.Des3d.P/neo-EF1 A-CKIα-IRES/eGFP與包裝質(zhì)粒（pLV/helper-SL3、pLV/helper-SLA、pLV/helper-SL5）混合，利用脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝攜帶CKIα基因的慢病毒顆

17、粒，然后感染大鼠BMSCs。在強(qiáng)力霉素(doxcycline)的誘導(dǎo)下，應(yīng)用RT-PCR方法檢測感染BMSCs CKIα基因表達(dá)情況，應(yīng)用Western blotting方法檢測感染BMSCsCKIα的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:通過酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及測序驗(yàn)證可誘導(dǎo)CKIα真核表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功;pLV.Des3d.P/neo-EF1A-CKIα-IRES/eGFP與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293FT細(xì)胞，成功獲得攜帶CKIα

18、基因的慢病毒顆粒，包裝產(chǎn)生病毒滴度為CKIα組5×107 TU/ml，繼之感染大鼠BMSCs，在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)條件下，經(jīng)過熒光顯微鏡檢測感染率達(dá)90％以上，應(yīng)用RT-PCR方法檢測重組CKIα基因表達(dá)情況，證實(shí)轉(zhuǎn)染組基因水平的表達(dá)量為陽性，未轉(zhuǎn)染組為陰性。應(yīng)用Western blotting方法檢測CKIα表達(dá)情況，證實(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)陽性;未轉(zhuǎn)染組表達(dá)為陰性。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建出可誘導(dǎo)表達(dá)CKIα基因的慢病毒載體，獲得濃縮Le