漢坦病毒雙M2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、目的:
　　 漢坦病毒(hantaan virus，HV)隸屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantavirus)，主要引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合癥(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)。我國(guó)是HFRS高發(fā)地區(qū)，1950至2007年期間，累計(jì)發(fā)病人數(shù)超過(guò)了150萬(wàn)，其中46000

2、多人死亡[1]，HFRS好發(fā)人群多是青壯年，并發(fā)癥多，因?yàn)镠FRS機(jī)制至今仍未完全闡明，且臨床上尚無(wú)特異性治療藥物，因此，疫苗的研制對(duì)HFRS防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 HV為單股負(fù)鏈RNA病毒，其核酸由大(L)、中(M)和小(S)三個(gè)基因片段組成，分別編碼病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)和核衣殼蛋白(nucleocapsidprotein，NP)。M編碼的包膜糖蛋白含有病毒的毒力位點(diǎn)、型特異性抗原位點(diǎn)、中和抗原

3、位點(diǎn)以及血凝抗原位點(diǎn)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對(duì)受感染動(dòng)物和人體產(chǎn)生保護(hù)作用，而糖蛋白的中和抗原位點(diǎn)主要位于G2上，推測(cè)可能是病毒分子結(jié)合宿主細(xì)胞的受體，是疫苗研究的重點(diǎn)[2-4]。
　　 與HFRS相關(guān)的HV亞型有四種:HTNV、SEOV、多布拉伐病毒(dobrav virus，DOBV)和普馬拉病毒(puumalavirus，PUUV)，其中HTNV、SEOV是我國(guó)HFRS的主要病原體，目前，我國(guó)臨床上廣泛應(yīng)用的是HV雙價(jià)滅

4、活疫苗，主要針對(duì)漢HTNV和SEOV而開(kāi)發(fā)，由于傳統(tǒng)疫苗存在研制周期長(zhǎng)，保護(hù)范圍窄，對(duì)發(fā)生變異的HNTV、SEOV和HV其他亞型不能起到有效的預(yù)防作用，病毒毒力“返祖”現(xiàn)象以及多抗原組分可能誘發(fā)的自身免疫性疾病等缺點(diǎn)，所以急需研制一種新型高效疫苗。由于基因工程疫苗表達(dá)量高，副效應(yīng)小，又利于工業(yè)化生產(chǎn)，成本比傳統(tǒng)疫苗更低廉，因此基因工程疫苗很快成為各國(guó)爭(zhēng)相開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的一種疫苗產(chǎn)品。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用反向疫苗學(xué)方法，利用生物信息學(xué)軟

5、件對(duì)HTNV、SEOV的包膜糖蛋白G2的抗原表位進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，各篩選出一段M2基因，分別插原核表達(dá)載體入pET-32a，PGEX-6P1中，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，以HFRS病人恢復(fù)期血清為一抗，通過(guò)Western-blotting檢測(cè)其抗原性，為HV基因工程蛋白質(zhì)疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 一、兩型M2基因片段的獲取
　　 利用反向疫苗學(xué)技術(shù)，對(duì)兩種M2基因片段的抗原決定簇、跨膜糖蛋白等進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，確

6、定PCR擴(kuò)增的片段。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增HTN76-118M2和SEO SeoulBjHD01 M2片段(簡(jiǎn)稱SEO M2)，并利用PCR在基因的兩端添加合適的酶切位點(diǎn)，瓊脂糖凝膠電泳回收后-20℃保存。
　　 二、構(gòu)建pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2重組載體
　　 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物76-118M2及pET-32a，回收76-118M2基因和開(kāi)環(huán)的pET

7、-32a質(zhì)粒，用T4連接酶將二者連接，構(gòu)建成pET-32a-76-118M2，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Origami B Strains的感受態(tài)細(xì)胞中，XbaⅠ/PstⅠ雙酶切鑒定后測(cè)序分析。同樣方法，用限制性內(nèi)切酶SalⅠ/NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物SEOM2和pGEX-6P1，回收SEOM2基因和開(kāi)環(huán)的pGEX-6P1，用T4連接酶將二者連接，構(gòu)建成pGEX-6P1-SEOM2，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞中，PstⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒

8、定后測(cè)序分析。
　　 三、誘導(dǎo)pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2表達(dá)蛋白
　　 分別挑取單菌落，于3ml培養(yǎng)基中200r震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以1∶50擴(kuò)大培養(yǎng)2小時(shí)，之后加入IPTG（1mg/ml）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)4h，超聲破碎細(xì)菌后，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。
　　 四、 pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2表達(dá)產(chǎn)物的抗原性分析
　　 重組蛋白pET-

9、32a-76-118M2，常規(guī)方法SDS-PAGE電泳，分別以His單克隆抗體和恢復(fù)期HFRS病人陽(yáng)性血清為一抗進(jìn)行Western-blotting，分析其抗原性。同樣，重組蛋白pGEX-6P1-SEOM2，常規(guī)方法SDS-PAGE電泳，分別以GST單克隆抗體和恢復(fù)期HFRS病人陽(yáng)性血清為一抗進(jìn)行Western-blotting，分析其抗原性。
　　 結(jié)果:
　　 一、76-118M2和SEOM2基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征

10、分析
　　 采用DNASTAR等生物軟件分析，結(jié)果顯示76-118M2和SEOM2基因編碼蛋白質(zhì)親水性和獨(dú)立抗原區(qū)域較多，柔性區(qū)域分布廣，是很好的基因工程疫苗候選蛋白。
　　 二、雙型M2基因片段的獲取
　　 PCR擴(kuò)增的76-118M2產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得大小約750bp條帶，擴(kuò)增SEOM2獲得大小約800bp條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 三、 PET-32a-76-118M2和PGEX-6P1-

11、SEOM2重組載體的鑒定
　　 前者經(jīng)XbaⅠ/PstⅠ雙酶切后，獲得兩個(gè)大小約為4000bp和2500bp的條帶，后者經(jīng)PstⅠ/EcoRⅠ雙酶切后，獲得兩個(gè)大小約為4000bp和1800bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)序列分析，所得的結(jié)果與Genebank中相應(yīng)的核苷酸序列比對(duì)，同源性達(dá)100％。
　　 四、 pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2表達(dá)蛋白的抗原性分析
　　 原核表達(dá)產(chǎn)物

12、76-118M2重組蛋白可分別與His單克隆抗體和恢復(fù)期HFRS病人陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，有45kD蛋白條帶，表明具有較好的抗原性。同樣，原核表達(dá)產(chǎn)物SEOM2重組蛋白可分別與GST單克隆抗體和恢復(fù)期HFRS病人陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，有56kD蛋白條帶，表明具有較好的抗原性。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建了漢坦病毒原核表達(dá)載體pET-32a-76-118M2和pGEX-6P1-SEOM2。
　　 2.成功誘導(dǎo)pET-