漢坦病毒76-118株M2基因的克隆及蛋白表達(dá).pdf

1、目的：漢坦病毒(HV)屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，是引起急性病毒性傳染病腎綜合癥出血熱(HFRS)的病原體。目前，根據(jù)血清學(xué)及分子生物學(xué)方法漢坦病毒又可分為漢灘病毒、漢城病毒、普馬拉病毒、希望山病毒等不同的型別，其中漢灘病毒、漢城病毒為我國最常見的兩種病毒。研究表明，漢坦病毒的包膜糖蛋白(G1、G2)可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對感染的動物和人起到保護(hù)作用，而糖蛋白的中和抗原位點(diǎn)主要位于G2上。本實驗旨在以質(zhì)粒pGEX-6P-1為載體，構(gòu)

2、建含有漢坦病毒76-118株M2基因的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/M2，并觀察G2蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)。 方法: 一、融合蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1/M2的構(gòu)建 (一)M2基因的克隆以漢坦病毒76-118株M基因為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到含完整編碼漢坦病毒G2蛋白基因M2的1600bpDNA片段，凝膠回收后-20℃保存。 (二)質(zhì)粒pMD18/M2的構(gòu)建將上述PCR產(chǎn)物與T載體pMD18分別

3、經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ消化后，在連接酶的作用下16℃連接約16h。連接產(chǎn)物10μl轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α，鋪LB平板并加入氨卞青霉素，37℃培養(yǎng)16h；篩選陽性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，以堿裂解法小量提取重組質(zhì)粒后，儲存于-20℃。 (三)原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/M2的構(gòu)建將重組質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pGEX-6P-1均用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后在T4DNA連接酶作用下于16℃連接約16h。連接產(chǎn)物10μl轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌

4、DH5α，鋪LB平板并加入氨卞青霉素，37℃培養(yǎng)16 h。 二、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定 按常規(guī)方法，將連接后所得的重組子轉(zhuǎn)化入感受態(tài)宿主菌E. coli BL-21，在含氨芐青霉素LB平板上鋪板，37℃溫箱過夜培養(yǎng)。第二天從平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床震蕩培養(yǎng)5h，快速堿裂解法粗提質(zhì)粒，-20℃保存。 三、重組蛋白GST-G2的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將含重組質(zhì)粒pGE

5、X-6P-1/M2的大腸桿菌BL-21接種于含Amp<'+>的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于1000ml含Amp<'+>的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約3h。加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心，收集菌體。加細(xì)菌裂解緩沖液超聲裂解細(xì)菌，離心取上清，對融合蛋白進(jìn)行親和層析純化。 四、SDS-PAGE電泳及Western-Blot分析 取純化后的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行S

6、DS-PAGE電泳，1h后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)印，PVDF膜經(jīng)TBS液洗滌10min后，封閉液封閉1h，再以TTBS洗滌兩次。加入用1：200封閉液稀釋的患者血清，4℃孵育過夜，經(jīng)TBS、TTBS洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗37℃孵育2h，TTBS、TBS洗滌，DAB顯色。 五、間接ELISA法檢測融合蛋白活性 以表達(dá)的融合蛋白為抗原，應(yīng)用間接ELISA法檢測50份HFRS陽性血清和10份正常人血清中抗?jié)h坦病毒抗體，分