A型流感病毒M2蛋白通用型單克隆抗體的制備及抗體特性的研究.pdf

1、A型流感病毒可以引起人類嚴(yán)重的呼吸道疾病，也是禽、馬、豬、貂、海豹及鯨的病原。A型流感病毒擁有眾多的亞型，病毒本身也在不斷地發(fā)生變異和重組。2013年中國爆發(fā)的人感染新型重組A型H7N9流感病毒，截止2016年12月通過《國際衛(wèi)生條例》報告，迄今共發(fā)生了807例人感染確診病例。流感的爆發(fā)給人類安全健康帶來嚴(yán)重的危害，也給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。A型流感病毒的復(fù)制周期短，在病毒復(fù)制過程中，M2蛋白對于病毒脫殼、組裝和釋放均發(fā)揮著重要的作

2、用。雖然M2蛋白較為保守，但不同亞型的M2蛋白抗原表位也有所不同。因此需要可以識別多個亞型M2蛋白的單克隆抗體，以便于不同流感亞型M2的研究。為了獲得可以識別多個A型流感病毒亞型M2蛋白的通用型單克隆抗體，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的A型流感病毒H3N2毒株序列，設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增H3N2M2基因，再通過融合PCR擴(kuò)增出缺失跨膜區(qū)的M2基因(sM2)。將擴(kuò)增的sM2目的片段構(gòu)建到pGEX-4T-1原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至B

3、L21(Plyss)表達(dá)菌種上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功大量表達(dá)融合蛋白GST-sM2，分子量大小37Ku。最后融合蛋白通過GST-Resin交聯(lián)瓊脂糖微球進(jìn)行非變性純化，獲得純度較高的GST-sM2重組蛋白。與此同時，根據(jù)H3N2M2氨基酸序列人工合成4條較為保守且可能具有抗原表位的多肽6-12、19-26、36-51和62-77，運(yùn)用雙功能試劑Sulfo-SMCC將四條多肽分別偶聯(lián)至BSA載體蛋白上，形成人工的合成抗原多肽BSA-Pep。

4、最后以純化的GST-sM2和抗原多肽BSA-Pep分別免疫小鼠，分別取脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)ELISA、IFA和Dot Blot的篩選一共獲得8株陽性單克隆抗體。其中由GST-sM2免疫小鼠篩選而來的5株單克隆抗體命名為10D9、10F4、8F4、6F2和6C1;由抗原多肽BSA-Pep免疫小鼠篩選而來的3株單克隆抗體命名為1E2、4B5和5G10。
　　為了初步確定單抗的抗原表位，將M2截短體（1～26aa和50～9

5、7aa）分別克隆至真核表達(dá)載體pGEFP-C3上，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以單抗為一抗進(jìn)行孵育，IFA檢測結(jié)果表明10F4單抗抗原表位位于N端1～26aa內(nèi)，而另外7株單抗的抗原表位則位于C端50～97aa內(nèi)。在初步確定抗原表位后，利用偶聯(lián)的抗原多肽BSA-Pep，采用Peptide-ELISA和Peptide-Dot Blot實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果一致顯示10F4的抗原表位位于N端6～12aa內(nèi)，而10D9、1E2、4B5和5G10的抗原表位則位于C

6、端62～77aa內(nèi)，但是6C1和6F2未能進(jìn)一步確定其抗原表位。
　　為鑒定單抗的通用型，將8株M2蛋白單克隆抗體分別與A型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N25個亞型進(jìn)行Western Blot和IFA的反應(yīng)性鑒定。鑒定結(jié)果顯示10D9單抗與5個亞型的M2蛋白均能特異性結(jié)合，而另外7株單抗則只能與1個或多個亞型反應(yīng)。為了驗(yàn)證10D9單抗的特性，以10D9單抗為一抗分別與H1～H1313種A型流感病毒亞型M2蛋

7、白進(jìn)行Western Blot和IFA的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，10D9單抗能與所有亞型的A型流感病毒M2蛋白反應(yīng)，且反應(yīng)性良好。10D9也能與同一亞型的不同毒株反應(yīng)。與PR8、H3N2、PiKa、H7N9、H9N2、GST-sM2和Myc-M2蛋白免疫共沉淀結(jié)果顯示，10D9能釣出不同來源的M2蛋白。以10D9抗體進(jìn)行中和試驗(yàn)時，發(fā)現(xiàn)10D9不具有抑制病毒復(fù)制的能力。10D9單抗分別對病毒感染和真核轉(zhuǎn)染的M2蛋白進(jìn)行細(xì)胞亞定位分析，激光