犬副流感病毒單克隆抗體的制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)首次于1967年從患呼吸道疾病的犬中分離獲得，是犬窩咳的主要病因之一。臨床表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕等呼吸道癥狀。當(dāng)與細(xì)菌、病毒等混合感染時(shí)，可引起犬的死亡。血清學(xué)調(diào)查表明CPIV在世界各國(guó)普遍流行?，F(xiàn)有的關(guān)于CPIV流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，在犬以及其他野生動(dòng)物的血清樣品中，CPIV的陽(yáng)性率較高。由于CPIV長(zhǎng)期困擾著養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展，所以需要一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的診斷方法來(lái)

2、對(duì)該病作出準(zhǔn)確診斷。
　　CPIV的NP蛋白是核衣殼蛋白的主要成分，與病毒RNA直接結(jié)合，高度保守，在病毒感染時(shí)可引起強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增NP基因，并將NP基因克隆到pET-30a載體，然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-NP，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。利用IPTG對(duì)重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組蛋白NP。對(duì)重組蛋白NP進(jìn)行純化鑒定，SDS-PAGE的試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋

3、白NP的分子量與預(yù)期大小相符;Westernblot的試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白NP能與CPIV陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)。
　　使用純化的重組NP蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，將SP2/0細(xì)胞與經(jīng)過(guò)免疫鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。用CPIV作為包被抗原，建立間接ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選得到3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，命名為2F1、3B9、4D11。Western blot試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)結(jié)果顯示，

4、3株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞上清均可以同CPIV發(fā)生特異性反應(yīng)。將4D11雜交細(xì)胞株腹腔注射小鼠，獲取腹水，測(cè)得腹水效價(jià)為1∶104。
　　本研究以CPIV作為檢測(cè)抗原，以4D11單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)抗體，建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法并且對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定試驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件。利用已建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)77份CPIV犬陽(yáng)性血清，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算得到陽(yáng)性臨界值為15.1％。該方法與犬細(xì)小病毒(CPV)血清、犬瘟熱病毒(CDV)血