鴨肝炎病毒單克隆抗體的制備及ELISA病毒檢測方法的建立.pdf

1、本試驗(yàn)應(yīng)用易感鴨胚和鴨胚原代肝胞培養(yǎng)1型鴨肝炎病毒(DHV-1)和新型鴨肝炎病毒(N-DHN),制備病毒液:采用反復(fù)凍融釋放病毒,氯仿去脂,0.22μm微孔濾膜過濾去除細(xì)菌和大分子雜質(zhì),透析法濃縮病毒,Sepharose CL-4B凝膠過濾純化病毒的方法;獲得了用于免疫小鼠制備脾細(xì)胞,免疫家兔制備多克隆抗體和間接ELISA檢測的純化抗原。
　　 使用純化抗原與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑混合乳化,制備免疫原;通過適當(dāng)?shù)拿庖叱绦蜃?/p>

2、射BALB/c小鼠,獲得了血清抗體效價(jià)高的免疫小鼠,為制備免疫脾細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)利用純化抗原建立了篩選陽性克隆和測定鼠抗體效價(jià)的間接ELISA方法。
　　 應(yīng)用常規(guī)技術(shù)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)咆進(jìn)行融合,用已建立的間接ELISA法,通過測定融合細(xì)胞分泌的抗體對DHV-1和N-DHV,以及健康鴨胚胚液的反應(yīng)性,經(jīng)過初篩和復(fù)檢,篩選出5孔分泌對DIN-1和N-DIN陽性,對健康鴨胚胚液陰性的抗體的雜交瘤細(xì)胞。利用有

3、限稀釋法,經(jīng)過5次亞克隆,擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)和腹腔注射BALB/c小鼠制備腹水抗體,獲得了2株穩(wěn)定分泌抗DHV-1和N-DHV抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為Ya4C7和Ga386。Ya4C7株細(xì)胞分泌單抗對2個(gè)血清型病毒的效價(jià)均為1:40:小鼠腹水單抗對N-DHV的效價(jià)大于1:100000,對DHV-1的效價(jià)為1:3200。Ga386株細(xì)胞分泌單抗對2個(gè)血清型病毒的均效價(jià)為1:20;小鼠腹水單抗對N-DHV的效價(jià)大于1:50000,對DHV-1

4、的效價(jià)為1:6400。Ya4C7株單抗對2型抗原的親和力大于Ga386株單抗。2個(gè)單抗均為IgGⅠ亞類且與其他鴨常見病原無交叉反應(yīng)。
　　 使用辛酸-硫酸銨法提純腹水單抗IgG和自制的高免兔血清中的IgG,經(jīng)蛋白含量測定、SDS-PAGE電泳分析和效價(jià)測定表明,純化后IgG的純度和活性都明顯提高。使用提純的鼠單抗IgG包被酶標(biāo)板,兔多抗IgG與病毒反應(yīng)和羊抗兔IgG酶標(biāo)物與之結(jié)合,建立了檢測DIN-1和N-DHV的改良雙夾心EL