酸性橙Ⅱ單克隆抗體的制備及其ELISA檢測方法的建立.pdf

1、酸性橙Ⅱ(Acid OrangeⅡ，AOⅡ)是一種化工染料，主要作為紡織品、皮革制品、塑料及木制品的染色劑，也可在醫(yī)學上用于組織染色。因其色澤艷麗、易于著色，常有商販非法將其用于食品著色。有研究證實酸性橙Ⅱ有一定的致畸作用和致癌性，在食品加工中使用，可能引起食物中毒，長期食用甚至會致癌，因此嚴禁將其作為食品添加劑使用。國家衛(wèi)生部2011年發(fā)布的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單中，明確規(guī)定禁止在食品中添加酸性橙Ⅱ。
　　文獻報道的

2、對食品中酸性橙Ⅱ的檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、反高效液相色譜法、超高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光光譜法、電化學分析法等，這些方法需要的儀器設備貴重、樣品處理過程更為復雜并要有專門的相關技術人員，難以滿足現(xiàn)場快速檢測。而免疫學檢測方法操作簡單易于攜帶，檢測效率高，適合對大批量樣品作現(xiàn)場快速篩選。目前僅有少數(shù)針對酸性橙Ⅱ的多克隆抗體，其免疫分析方法的特異性較低，效果較單克隆抗體差很多。
　　本實驗采用琥珀酸酐法

3、和鹵代羧酸法合成了酸性橙Ⅱ完全抗原，經(jīng)過透析、鑒定后獲得免疫原和包被原。用合成的免疫原分批免疫BALB/c小鼠，利用單克隆抗體技術、ELISA檢測法及小鼠腹水制備等技術，制備出針對酸性橙Ⅱ特異性強、效價高的單克隆抗體，并建立ELISA檢測方法。
　　1.AOⅡ完全抗原的合成與鑒定
　　酸性橙Ⅱ分子結構中沒有能夠直接與蛋白進行偶聯(lián)的基團，分別采用一氯醋酸鈉法和琥珀酸酐法對酸性橙Ⅱ中的酚羥基進行修飾，連接上帶有羧基的間隔臂，再經(jīng)

4、活性脂法(NHS)與載體蛋白偶聯(lián)，成功制備出酸性橙Ⅱ的免疫原和包被原。經(jīng)紫外光譜掃描和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，可初步判定人工抗原偶聯(lián)成功。經(jīng)動物免疫和ELISA測定，均檢測到產(chǎn)生抗體，表明兩種抗原的制備是成功的。利用BCA試劑盒測得AOⅡ-BSA和AOⅡ-OVA的蛋白濃度分別為2.35mg/mL和1.60mg/mL; AOⅡ-BSA(B)和AOⅡ-OVA(B)的蛋白濃度分別為4.12mg/mL和3.11 mg/mL。
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5、.AOⅡ單抗的制備
　　以合成的人工抗原AOⅡ-BSA、AOⅡ-BSA(B)作為免疫原，按照實驗室常規(guī)免疫程序免疫BALB/c小鼠（方法A合成的免疫2只，方法B合成的免疫3只）。以AOⅡ-OVA和AOⅡ-OVA(B)分別做包被原，五免后7d小鼠剪尾采血，測血清效價及抑制情況，血清效價達1∶16000以上。經(jīng)細胞融合、ELISA篩選和有限稀釋法進行亞克隆，最終獲得三株可持續(xù)分泌針對AOⅡ抗體的雜交瘤細胞株4D3、4F10和7E10。

6、利用小鼠體內(nèi)誘生法制備出抗AOⅡ單克隆抗體的腹水，其中4F10效價最好達96000，蛋白濃度為20.4 mg/mL。腹水4F10經(jīng)純化后SDS-PAGE凝膠鑒定雜蛋白明顯減少。交叉實驗結果表明，該單抗與堿性黃、莧菜紅、蘇丹紅Ⅰ、副品紅、羅丹明B、胭脂紅、檸檬黃、日落黃沒有交叉反應，而對酸性橙Ⅱ的抑制率達100％。
　　3.ELISA檢測方法的建立
　　用純化后的4F10單克隆抗體建立檢測AOⅡ的間接競爭ELISA方法，包被原

7、最佳稀釋濃度1∶4000，純化后抗體的最佳工作濃度1∶24000，AOⅡ濃度在20～2000ng/mL時，標準曲線線性良好，線性方程為y=0.3363x-0.2732(R2=0.989)，IC50為198.13ng/mL，LOD低于16.69ng/mL，LOQ為52.22ng/mL。
　　4.鹵肉中AOⅡ添加回收試驗
　　鹵肉樣品添加回收實驗，實驗測定前先對鹵肉樣品進行前處理。將樣品處理液稀釋16倍以上時，可基本消除樣品的基