漢坦病毒重組核蛋白的表達(dá)及其應(yīng)用研究.pdf

1、[目的] 以漢坦病毒SEO型L99株S基因的重組株E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S為研究對(duì)象，進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)、純化其編碼的重組核蛋白(rNP)，并制備免疫血清，建立免疫學(xué)方法用于檢測(cè)病人的血清抗體和動(dòng)物肺組織中的抗原。 [方法] 1.優(yōu)化E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S的rNP表達(dá)條件，觀察3個(gè)因素(溫度、時(shí)間、IPTG濃度)18個(gè)條件對(duì)rNP表達(dá)情況的影響，用SDS-P

2、AGE分析目的蛋白的濃度、占菌體總蛋白的百分含量及溶解情況。 2.E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S超聲破碎后，包涵體經(jīng)洗滌和增溶，取其上清部分進(jìn)行鎳親和層析純化，收集目的蛋白峰，進(jìn)一步透析和濃縮后將所獲純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析純度并用Bradford法測(cè)定其濃度，用Western-blot鑒定其抗原性。 3.用純化的rNP免疫日本大耳白兔，制備免疫血清，ELISA測(cè)定血清效價(jià)，Western-

3、blot鑒定其免疫原性。 4.純化的rNP用于三種不同的ELISA：rNP-ELISA、HRP-rNP-EIASA和免疫磁性微球ELISA(IMMS-rNP-ELISA)，選用HFRS病人陽(yáng)性血清和健康人血清，比較不同方法的靈敏度和特異度。 5.分別以兔rNP抗血清和HFRS病人混合血清為一抗用于間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)59份鼠肺組織標(biāo)本中的HV抗原。將兩種IFA檢測(cè)結(jié)果不一致的鼠肺標(biāo)本采用RT-nested-PCR

4、比較其結(jié)果。 [結(jié)果] 1.確定rNP表達(dá)的最佳條件，即IPTG0.5mmol/L、30℃誘導(dǎo)5h，其表達(dá)量可達(dá)626.04μg/ml，占菌體總蛋白的52.2％，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在。 2.超聲處理后，用鎳親和層析純化rNP，在連續(xù)梯度洗脫中收集咪唑濃度在250-300mmol/L的洗脫液，所獲rNP純度達(dá)95％以上，蛋白濃度為18.01mg/ml，總回收率為28.9％，提純倍數(shù)1.83，Western-

5、blot顯示純化蛋白與HFRS病人血清反應(yīng)有良好的抗原性。 3.純化rNP制備抗血清，抗體效價(jià)達(dá)512000以上。Westernblot顯示：純化的rNP與兔rNP抗血清反應(yīng)條帶單一。 4.三種ELISA檢測(cè)病人血清IgG抗體，rNP-ELISA，HRP-rNP-ELISA法和IMMS-rNP-ELISA的靈敏度分別為100％、92.5％、100％，特異度分別為95％、100％、100％。 5.用兩種IFA檢測(cè)5

6、9份鼠肺冰凍切片的HV抗原，一抗為兔rNP抗血清的IFA有14份陽(yáng)性，占23.7％；一抗為患者混和血清的IFA有10份陽(yáng)性，占16.9％。兔rNP抗血清IFA的切片背景清晰，易于判斷。將上述兩種IFA檢測(cè)結(jié)果不一致的6份鼠肺標(biāo)本進(jìn)行RT-nested-PCR，均與兔rNP抗血清IFA的結(jié)果相一致。 [結(jié)論] 1.確定了重組菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-L99S的rNP最佳表達(dá)和純化條件。 2.以