漢坦病毒核衣殼蛋白抗原多肽片段的合成與應用_第1頁
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文檔簡介

1、<p>  漢坦病毒核衣殼蛋白抗原多肽片段的合成與應用</p><p>  【關鍵詞】 腎綜合征出血熱 </p><p>  關鍵詞 :腎綜合征出血熱;漢坦病毒;病毒殼體;表位作圖;肽合成;酶聯(lián)免疫吸附測定 </p><p>  摘 要:目的 以合成肽為抗原建立新型特異性檢測抗?jié)h坦病毒IgG和IgM的ELISA. 方法 用多肽合成儀合成漢坦病毒核衣

2、殼蛋白(aa17-66)50個氨基酸殘基的核心序列,以此為抗原,通過實驗發(fā)現(xiàn)這一序列具有較強的抗原性,首次建立了以合成肽為抗原的新型特異性檢測抗?jié)h坦病毒IgG和IgM的ELISA.測定腎綜合征出血熱(HFRS)患者血清23份,乙型肝炎患者血清9份,正常人血清11份. 結果 乙型肝炎患者血清和正常人血清均為陰性,20份HFRS血清IgG陽性,21份HFRS血清IgM陽性.本方法的相對敏感性為86%和91%,相對特異性為100%,符合率為

3、93%和95%. 結論 本法特異性強,靈敏度高,簡便易行,是適于基層醫(yī)療單位的診斷方法. </p><p>  Keywords:hemorrhagic fever with renal syndrome;Hantaan-virus;capsid;epitope mapping;peptide synthe-sis;enzyme-linked immunostorbent assay </p>&

4、lt;p>  Abstract:AIM To establish a new specific serological diag-nostic method to test HFRS.METHODS Epitope(aa17-66)of nucleocapsid protein was synthesized by solid-phase pep-tide synthesis.Then the synthetic peptide

5、was applied as an antigen to test the specific antibody(IgG,IgM)by ELISA.Twenty-three sera from HFRS patients,9from HBV patients and11from healthy people were detected.RESULTS All sera from HBV patients and healthy peopl

6、e were negative,20from HFRS patients for anti-HV IgG positive and21ser</p><p><b>  0 引言 </b></p><p>  腎綜合征出血熱(HFRS)為布尼亞病毒科漢坦病毒屬病毒(Hantavirus,HV)引起的自然疫源性傳染病,我國是HFRS流行的主要國家[1-3] .HV基因組

7、由L,M,S三個片段構成,分別編碼病毒RNA聚合酶、囊膜糖蛋白G1和G2及核衣殼蛋白(簡稱核蛋白,Nucleocapsid protein,NP)[4,5] .囊膜糖蛋白上具有中和及血凝抗原位點,可誘導中和抗體和保護性細胞免疫反應;核蛋白上雖無中和性抗原位點,但仍可誘導保護性細胞免疫,現(xiàn)有研究表明,在核蛋白上也可能有中和性抗原位點存在[6,7] .血清學研究表明,漢坦病毒核蛋白具有很強的抗原性和免疫原性,患者對核蛋白的抗體不僅出現(xiàn)早,且

8、滴度高[8] .應用單克隆抗體進行的研究表明,抗NP血清或單抗雖然沒有中和活性,但用NP免疫的動物仍可產生一定的抗病毒免疫[9-11] .此外還發(fā)現(xiàn)抗NP血清或單抗可與多種血清型病毒抗原產生交叉反應,而NP抗原也可與漢坦病毒屬內的多種血清型病毒的免疫血清產生交叉反應,表明漢坦病毒NP具有共同的抗原決定簇[12,13] .Vapalahti等[9] 應用PERSCAN技術,對連續(xù)交錯合成的覆蓋NP全</p><p>

9、;  我們根據(jù)以上結果,用Antheprot4.3蛋白序列分析軟件包,通過計算機對S片段編碼蛋白各區(qū)域進行親疏水性、抗原性和二級結構預測.采用固相多肽合成法合成了NP(aa17-66)多肽.發(fā)現(xiàn)這個多肽序列抗原性較強,同時建立了以合成肽為抗原的新型特異性檢測抗?jié)h坦病毒IgG和IgM的ELISA測定法. </p><p><b>  1 材料和方法 </b></p><p&

10、gt;<b>  1.1 材料 </b></p><p> ?、匐暮铣蓛x及其主要試劑:Pioneer Peptide Synthesis System(先鋒多肽合成儀)、9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)-PAL-PEG-PS樹脂、Fmoc-L-氨基酸、縮合劑:O-苯并三唑基-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、脫保護劑:200g&#12539;L-1 哌啶的二甲基甲酰胺

11、溶液、二甲基甲酰胺(DMF)、二異丙基乙胺(DIEA)、三氟乙酸(美國PerSeptive Biosystems公司);甲醇(HPLC級)(天津四友生物醫(yī)學技術有限公司產品);苯甲基硫醚、1,2-巰基乙烷、苯甲基醚(Sigma公司產品);②血清標本:收集西安地區(qū)腎綜合征出血熱患者血清23份,乙型肝炎患者血清9份,正常人血清11份.③ELISA試劑:采用丹麥產96孔可拆式Nunc Maxi Sorp聚苯乙烯酶標板,包被抗原用的緩沖液為0.

12、02mol&#12539;L-1 pH8.0Tris-HCl緩沖液;封閉液為10g&#12539;L-1 明膠的0.02mol&#12539;L-1 pH7.4PBS或300mL&#12539;L-1 滅活小牛血清的PBST,0.02mo</p><p><b>  1.2 方法 </b></p><p>  1.2.1 NP序列的計算

13、機模擬分析 </p><p>  用Anthep-rot4.3蛋白序列分析軟件包,通過計算機對S片段編碼蛋白各區(qū)域進行親疏水性、抗原性和二級結構預測.確定NP抗原表位多肽的氨基酸序列. </p><p>  1.2.2 NP(aa17-66)抗原表位多肽的合成 </p><p>  在先鋒多肽合成儀上起始Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂,按多肽序列從C端逐

14、個向N端延伸.所用保護基團是:各氨基酸的α-氨基為Fmoc-保護.其中有些殘基側鏈帶有保護基團,它們是:Gln(三苯甲基(Trt)),Arg(2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫吡喃-6-苯磺?;╬bf)),Lys(叔丁基氧羰基(Boc)),Asp(叔丁酯(Ot-Bu)),Glu(OtBu),Asn(Trt),Ser(叔丁基(tBu)),Thr(tBu),Tyr(tBu).用200g&#12539;L-1 哌啶的二甲基甲酰胺溶液

15、脫除Fmoc保護基,加TBTU以活化保護氨基酸的羧基,合成了50個氨基酸殘基多肽.合成儀自動在線檢測每一個氨基酸的連接效率. </p><p>  1.2.3 合成肽的裂解與去除保護基團 </p><p>  肽合成后,把結合有肽的樹脂放入真空干燥器中,干燥4h,然后用三氟乙酸、苯甲基硫醚、苯甲基醚、1,2-巰基乙烷,按體積比90∶5∶2∶3比例混合,室溫避光處理4h;把肽鏈從樹脂上裂

16、解下來,同時除去肽鏈上其它保護基.然后過濾到冷乙醚中,此時有白色沉淀產生;再用不同濃度的醋酸抽提肽,冷凍干燥;經Sephadex G-25柱脫鹽,再經高壓液相反相層析柱C18分離純化,得到HPLC純的肽. </p><p>  1.2.4 合成肽的包被及封閉 </p><p>  用包被緩沖液將多肽抗原稀釋至10mg&#12539;L-1 ,酶標板每孔加入0.1mL,置37℃1

17、2h后棄去包被液,甩干后每孔加封閉液0.2mL,置37℃2h.洗滌3次,每次在加滿洗滌液后放置3~5min,然后用力甩干液體,拍干.封裝后4℃貯存供間接ELISA法檢測抗HFRS用.每孔加入0.1mL預先用稀釋液稀釋100倍的血清標本(測抗HFRS IgM時,在稀釋血清標本中加入10μL羊抗人IgG),置37℃培養(yǎng)箱保溫1h.洗滌5次,再每孔加入酶標記的羊抗人IgG或IgM0.1mL,37℃溫育45min.洗滌5次,每孔加入0.1mL新

18、鮮配制的底物液,置37℃反應15min.最后每孔加2mol&#12539;L-1 硫酸25μL終止反應,在酶標儀上(波長=492nm)測定每孔吸光度A(OD值).3個陰性血清的平均A值加3個標準差(x ±3s)為本方法陽性判斷值. </p><p><b>  2 結果 </b></p><p>  2.1 NP序列的計算機模擬分析 </p&

19、gt;<p>  對S片段編碼蛋白各區(qū)域進行親疏水性、抗原性和二級結構預測.發(fā)現(xiàn)NP(aa17-66)區(qū)段親水性高,含α-螺旋、β-轉角及β-折疊區(qū)域,并易形成折曲抗原表位(Fig1). 表1 NP(aa17-66)合成肽的氨基酸組成分析(略) </p><p>  2.2 肽合成效率及合成肽的純化和鑒定 </p><p>  先鋒多肽合成儀能自動在線檢測每一個氨基酸的連

20、接效率.Fig2為先鋒多肽合成儀合成多肽時自動顯示的合成的情況,圖上的每一個條柱代表一個氨基酸的偶聯(lián)情況,條柱的高低反映了每一個氨基酸的連接效率,如果某個條柱低于一定的數(shù)值時,合成儀能自動停止合成,并顯示合成失敗.根據(jù)Fig2,本次合成的多肽每一步聯(lián)接效率均在95%以上.合成的NP(aa17-66)肽段位于NP的氨基端親水區(qū).經Sephadex G-25脫鹽,再經高壓液相反相層析柱C18分離純化,得到HPLC單一峰的肽,如Fig3所示.

21、所用色譜的色譜柱為ODS柱(C18,250mm×4.6mm);流動相:A為甲醇,B為異丙醇;梯度洗脫時間為50min,流動相A從100%變化到0,B從0變化到100%;流速為0.5mL&#12539;min-1 ;檢測波長280nm.最后經氨基酸分析儀分析,此肽的氨基酸組成符合其理論值(Tab1). 表2 不同包被液對檢測結果的影響(略) </p><p>  2.3 多肽抗原包被液及封閉液的選

22、擇 </p><p>  用0.02mol&#12539;L-1 pH8.0Tris-HCl,0.02mol&#12539;L-1 pH7.2PBS和0.05mol&#12539;L-1 pH9.6碳酸鹽緩沖液包被多肽抗原,在相同條件下測定陽性、陰性血清.據(jù)實驗結果確定3種包被液的包被效果(Tab2).可見,用Tris-HCl作抗原包被液,陽性血清A值最高,故我們采用Tris-HCl包

23、被液.分別用10g&#12539;L-1 明膠0.02mol&#12539;L-1 pH7.4PBS(1號)、300mL&#12539;L-1 滅活小牛 血清PBST,0.02mol&#12539;L-1 pH7.4PBS,0.5g&#12539;L-1 Tween-20(2號)和內含50g&#12539;L-1 脫脂奶粉的0.02mol&#12539;L-1 pH7.2PBS(3

24、號),封閉多肽抗原,在相同條件下測定陽性、陰性血清,觀察3種封閉液的效果(Tab3).可見,用1號或2號作抗原封閉液,陽性血清與陰性血清吸光值差異大,相差大于20倍.而3號作抗原封閉液,陽性血清與陰性血清吸光值差異小,相差小于3倍,特別是大部分陰性血清A</p><p>  2.4 方法的精密度、重復性和穩(wěn)定性 </p><p>  實驗標本為抗HFRS IgG及IgM均呈陽性的3份患

25、者血清.抗HFRS IgG的批內變異系數(shù)(CV)為3.3%~4.8%;批間CV為8.1%~11.0%(Tab4).抗HFRS IgM的批內CV為3.8%~5.3%;批間CV為7.2%~9.1%.由此表明本方法的批內及批間均符合精密度的標準要求.把已包被多肽抗原的聚苯乙烯酶標板進行封閉、干燥后置4℃冰箱保存,每隔一定時間測定1次,觀察板上抗原的穩(wěn)定性,共觀察了5mo,測定結果無明顯差異.提示多肽抗原板在4℃至少可穩(wěn)定5mo.表4 抗HFR

26、S ELISA的精密度實驗結果(略) </p><p>  2.5 血清標本的測定 </p><p>  用本法測定HFRS患者血清23份,乙型肝炎患者血清9份,正常人血清11份. </p><p>  結果發(fā)現(xiàn),乙型肝炎患者血清和正常人血清均為陰性,20份HFRS血清IgG陽性,21份HFRS血清IgM陽性.本方法的相對敏感性為86%(20/23)和91%(2

27、1/23),相對特異性為100%(20/20),符合率為93%(40/43)和95%(41/43). </p><p><b>  3 討論 </b></p><p>  在檢測抗HFRS抗體中以ELISA應用最為普遍.目前測定中所用的抗原有2種:①HFRS病毒裂解物,它的抗原譜廣泛,但含有宿主細胞成份,因此易產生假陽性結果,而且此類抗原具有一定的傳染性.②用基因重組

28、技術產生的病毒特異性抗原,這種抗原目前常用大腸桿菌來制備或噬菌體表面呈現(xiàn)技術來制備,因此難免會帶有雜蛋白而產生假陽性結果,且重組多肽分子量大,有不少非特異性結構,可能會與其它病毒的抗體交叉反應[18] .用人工合成的多肽抗原,這種抗原沒有細胞和細菌蛋白的混雜,而且分子量小,結構簡單,可將幾個片段重合使用,有較高的特異性和敏感性,從而避免了與其它病毒、細菌抗體交叉反應的可能[19] .HFRS抗體的測定,可作為判斷HFRS感染的標志,已成

29、為基層實驗室診斷HFRS感染的主要方法.ELISA本身的優(yōu)越性和HFRS多肽抗原的特異性使本方法更具特色.它的結果可由儀器客觀記錄,也可采用目測法判斷(在測定最后每孔不加硫酸終止反應),以待測樣品孔顏色明顯深于陰性對照孔為陽性.由于采用96孔聚苯乙烯板作為固相載體,既可一次處理許多標本,也可多次分割使用,為操作者帶來了方便[20] .白雪帆等[16,17] 用</p><p><b>  參考文獻: &

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