鵝細(xì)小病毒SRW株VP2基因克隆及原核表達(dá).pdf

1、小鵝瘟(Goose plague，GP)由我國(guó)方定一等于1956年在揚(yáng)州發(fā)現(xiàn)，并于1961年用鵝胚分離到小鵝瘟病毒(GP Virus，GPV)。匈牙利學(xué)者Derzsy于1967年將其命名為鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)。GPV屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、細(xì)小病毒屬(Parvovirus)，基因組大小為5106bp，由左右兩側(cè)兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)組成。左側(cè)O

2、RF(LORF)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，右側(cè)ORF(RORF)編碼VP1、VP2及VP3三種結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明，VP2能誘導(dǎo)鵝體產(chǎn)生中和抗體，屬于保護(hù)性抗原。為研究GPV基因工程疫苗，本文克隆到GPV SRW株VP2基因并在E．coli中獲得了表達(dá)。 參照GenBank中收錄的GPV B株(登錄號(hào)U25749)VP2基因序列，設(shè)計(jì)帶有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增VP2基岡的特異引物。采用PCR方法從GPV SRW

3、株基因組中擴(kuò)增出VP2基因，通過(guò)限制內(nèi)切酶定點(diǎn)克隆到pUCm-T載體中。序列測(cè)定結(jié)果表明，克隆得到的GPV SRW株VP2基因大小為1758bp，與GPV B株同源性達(dá)98.46％；推導(dǎo)的氨基酸序列與報(bào)道的共計(jì)10株GPV毒株的VP2氨基酸序列同源性為94.18％；推導(dǎo)的蛋白抗原性指數(shù)及親水性分布與GPV B株VP2無(wú)顯著差異。 將GPV SRW株VP2基因亞克隆到表達(dá)載體pET-21a上，獲得表達(dá)重組子pE-VP2。經(jīng)BamH

4、 Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定后，序列分析確定該重組子中SRW株VP2基因ORF正確，轉(zhuǎn)化E．coli BL21(DE3)，獲得了基因工程菌株E．coli BL21(GVP2)。經(jīng)優(yōu)化的誘導(dǎo)條件是，1mM的IPTG和30℃培養(yǎng)，E．coli BL21(GVP2)菌體經(jīng)超聲波處理后的裂解物，離心沉淀，經(jīng)6M鹽酸胍變性以及N2+親和層析純化，SDS-PAGE檢測(cè)純化樣品中含有74kDa蛋白，Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白與兔抗GPV S