鵝細(xì)小病毒VP基因片段在原核系統(tǒng)中的表達(dá)及抗血清的制備.pdf

1、將編碼Gooseparvovirus(GPV)HG5/82株病毒衣殼蛋白的基因分為三個(gè)有部分重合的基因片斷，它們分別是從VP1的5'-端到662位核苷酸，從VP2的5'-端到969位核苷酸及從VP3的3'-端到864位核苷酸的基因片段，這三個(gè)片段的兩個(gè)重合區(qū)分別包含了VP2-VP3非重合區(qū)和VP3的中部，再分別將這三個(gè)基因片斷連入原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并將它們相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物命名為F1、F2、F3。前期工作已經(jīng)完成了F2的原核表達(dá)純化、

2、抗血清的制備及其免疫活性的檢測(cè)。 本研究將VP1的5'-端到662位核苷酸和從VP3的3'-端到864位核苷酸的基因片段分別連入原核表達(dá)載體pPROEXTMHTb和pET30a中，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行確證性序列測(cè)定。再把這兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α和BL21，用IPTG誘導(dǎo)后分別表達(dá)出與預(yù)期大小相符的約32kDa和34kDa的融合蛋白。將它們分別命名為F1和F3，通過(guò)薄層掃描分析顯示F1表達(dá)量最多可占工程菌菌體總蛋白

3、的22.8％。分別誘導(dǎo)兩種工程菌后用6mol/L鹽酸胍裂解，再經(jīng)超聲處理后離心，用鎳離子親和樹(shù)脂對(duì)裂解產(chǎn)物的上清進(jìn)行純化，用于分別制備F1和F3的兔抗血清。Westernblot結(jié)果表明：F1的抗血清不但能與F1反應(yīng)還能與親本株GPVHG5/82的兩條蛋白帶發(fā)生反應(yīng)，這兩條蛋白帶的分子量分別為88kDa和77kDa，它們的大小分別與GPVVP1和VP2的相對(duì)分子量相同；F3的抗血清不但能與F3反應(yīng)還能與親本株GPVHG5/82的四條蛋白

4、帶發(fā)生反應(yīng)，這四條蛋白帶的分子量分別為88kDa、77kDa、65kDa和60kDa，其中分子量為88kDa、77kDa和60kDa的蛋白帶分別與GPV的三種結(jié)構(gòu)蛋白，即VP1、VP2和VP3的分子量一致。該結(jié)果證明融合蛋白F1和F3與F2一樣具有良好的免疫原性。由于GPV三種結(jié)構(gòu)蛋白具有共同的羧基端，因此在理論上，存在于VP3的表位應(yīng)該也存在于VP1和VP2；存在于VP2的抗原表位應(yīng)該也存在于VP1。通過(guò)分析F1、F2和F3的兔抗血清