馬鈴薯S病毒外殼蛋白的原核表達(dá)及其抗血清的制備.pdf

1、本研究的目的是構(gòu)建馬鈴薯S病毒外殼蛋白基因的原核表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中高效表達(dá)，用表達(dá)的融合蛋白作為抗原制備抗血清，為進(jìn)一步制備馬鈴薯S病毒的ELISA檢測試劑盒打基礎(chǔ)?！　∮肞VS-cp基因的上、下游引物及pGEM-pvs模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物為一條分子量約為890bp的特異條帶。用Ultrafree-DA試劑盒一步離心法回收890bp的特異擴(kuò)增片段，然后與T表達(dá)載體pBAD/Thio連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受

2、體菌TOP10。經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選、質(zhì)粒電泳檢測、PCR擴(kuò)增及SphI與PstI限制性內(nèi)切酶的單酶切和雙酶切鑒定，篩選到了陽性克隆，相應(yīng)的重組質(zhì)粒被命名為pBAD-pvs。單獨(dú)使用基因的引物或混合使用基因及載體的引物進(jìn)行PCR檢測，獲得了目的基因正向插入表達(dá)載體的目的克隆，對應(yīng)的重組質(zhì)粒命名為pBAD-pvs+?！　≈亟M質(zhì)粒pBAD-pvs+中外源基因是受阿拉伯糖啟動子控制表達(dá)的。在42℃，TOP10(pBAD-pvs+)用2％阿拉

3、伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時后，SDS-PAGE凝膠電泳顯示表達(dá)產(chǎn)物中有一條分子量為46KDa的特異性蛋白條帶，其大小與預(yù)期的融合蛋白相符，該蛋白在總蛋白中的含量為20.22％。在硝酸纖維素膜上進(jìn)行Westernblotting分析，結(jié)果顯示該融合蛋白與PVS-IgG有反應(yīng)，形成明顯的雜交帶，表明該融合蛋白是PVS-cp嵌合基因正確表達(dá)的產(chǎn)物。　　用溶菌酶破碎菌體，提取總蛋白，SDS-PAGE顯示表達(dá)的融合蛋白主要以包涵體的形式存在。經(jīng)4M尿素

4、洗滌后的包涵體蛋白，用超純水4℃過夜溶解，SDS-PAGE顯示得到了只含有該融合蛋白的水溶液，即建立了純化該融合蛋白比較簡便的方法。經(jīng)洗滌后的包涵體蛋白用6M尿素溶解，在氧化型和還原型谷胱甘肽存在的條件下復(fù)性，電泳顯示得到了該融合蛋白純度較高的水溶液。兩種途徑獲得的蛋白溶液經(jīng)濃縮透析后作為制備抗血清的抗原。　　除采用上述兩種蛋白溶液外，含目的蛋白的SDS-PAGE膠條經(jīng)液氮研磨后的粉末也作為抗原。三種抗原同時免疫家兔，制備出了三種抗血