牛種布魯氏菌表面蛋白SP41的克隆、原核表達(dá)及抗血清的制備.pdf

1、本研究的目的是克隆牛種布魯氏菌SP41基因并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中高效表達(dá)，用表達(dá)的融合蛋白為抗原作為抗原制備抗血清，為進(jìn)一步制備布魯氏菌病ELISA檢測試劑盒打基礎(chǔ)。
　　 以布魯氏菌A19疫苗株基因組DNA為模板，利用設(shè)計的一對特異性引物對牛種布魯氏菌SP41基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了一條完整的基因，大小為1302bp，然后通過T-A克隆將其連接至pEASY-T3載體上，經(jīng)PCR和酶切鑒定表明克隆載體構(gòu)建成功。

2、將構(gòu)建好的克隆載體進(jìn)行測序，測序結(jié)果證明克隆的基因片段全長1302個核苷酸，編碼433個氨基酸的成熟多肽，與已報道的與布魯氏菌2308、A-13334、S19、9-941序列的核苷酸同源性為100％，與ATCC、CCM4915、M28、M5-90、NI同源性均為99.8％，且其與9-941編碼氨基酸序列完全一致。
　　 將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中，經(jīng)酶切、PCR鑒定和測序分析，表明重組表達(dá)載體pET-32a(+)

3、-SP41構(gòu)建成功，將此重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，該基因可以在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為分子量約66kDa的融合蛋白，與預(yù)期大小符合。通過對誘導(dǎo)條件的摸索發(fā)現(xiàn)，IPTG濃度對蛋白表達(dá)的影響不大，而37℃，誘導(dǎo)6h，表達(dá)效果最好。Western-blotting結(jié)果顯示，所得重組蛋白具有良好的免疫源性。利用Ni-NTA柱進(jìn)行純化，得到了純化目的蛋白。將純化的目的