牛瑟氏泰勒蟲(chóng)p23表面蛋白基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲(chóng)（Theileria sergenti）寄生于牛紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞引起的一種血液原蟲(chóng)病。近些年，瑟氏泰勒蟲(chóng)病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，給相關(guān)國(guó)家的畜牧業(yè)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道T.sergenti梨漿蟲(chóng)表面蛋白p23表達(dá)于瑟氏泰勒蟲(chóng)裂殖子膜表面，是主要免疫原性蛋白之一。
　　本研究根據(jù)GenBank牛瑟氏泰勒蟲(chóng)日本株p23表面蛋白基因（D84447）設(shè)計(jì)了一對(duì)特異

2、性引物，利用全血基因組DNA提取試劑盒提取了牛瑟氏泰勒蟲(chóng)基因組DNA，克隆了大小為507 bp的p23表面蛋白基因的部分片段，對(duì)所克隆的p23基因序列與基因庫(kù)中 D84447序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果同源性達(dá)99.4％，證明該基因片段確為牛瑟氏泰勒蟲(chóng)p23表面蛋白基因。p23表面蛋白基因與pGEX-4T-1載體進(jìn)行連接、酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序，成功地構(gòu)建了含有目的基因片段的原核表達(dá)載體pGEX-4T-p23。然后將原核表達(dá)載體pGEX-

3、4T-p23轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)出約46 ku的p23融合蛋白。同時(shí)根據(jù)SDS-PAGE對(duì)融合蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)是轉(zhuǎn)接種后2.0 h，最佳誘導(dǎo)溫度是34℃，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6.0 h，最適IPTG濃度為0.08 mmol/L。在優(yōu)化條件下融合蛋白的表達(dá)量經(jīng)Bandscan5.0軟件分析占菌體總蛋白的31.7%，Western blotting檢測(cè)，該融合蛋白可被牛瑟氏泰勒蟲(chóng)陽(yáng)