青島文昌魚p23基因的克隆、鑒定、表達、純化和功能分析.pdf

1、p23蛋白作為熱激蛋白90(Hsp90)的輔助分子伴侶(cochaperone)，在真核細胞內(nèi)對許多重要的調(diào)控因子和信號蛋白具有調(diào)節(jié)作用。文昌魚(Amphioxus)是介于無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡類型，是研究脊椎動物進化的珍貴材料。利用分子生物學手段和生物信息學方法，研究文昌魚p23基因的結(jié)構(gòu)、進化和表達，可以揭示文昌魚p23基因與無脊椎動物和脊椎動物p23基因之間的相互關(guān)系及其表達模式的異同，有助于從分子水平上闡釋脊椎動物的起源

2、和進化。本文從青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)腸cDNA文庫(本實驗室保存)中，克隆了具有完整編碼框的p23基因(AmphiP23)，并對其結(jié)構(gòu)、表達和進化展開了研究。AmphiP23全長1455bp，編碼170個氨基酸組成的蛋白。該蛋白在氨基酸水平上與人、小鼠、雞、爪蟾、斑馬魚、海鞘、果蠅、線蟲等的p23蛋白的相似性為25.3％-34.7％，與人的tsp23相似性為21.2％，且具有

3、典型的p23保守域(8-114殘基)和p23蛋白共有的保守殘基(8W，79K，86W，89L，106W,，人的氨基酸序號)。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，無脊椎動物和脊椎動物p23蛋白分化為兩個組群，而Amphip23介于脊椎動物和無脊椎動物p23蛋白之間，說明脊椎動物和無脊椎動物p23基因是在5.5億年前由共同的祖先分化而成。人tsp23蛋白位于脊椎動物進化枝的基部，說明tsp23可能比脊椎動物p23蛋白更原始，脊椎動物p23和tsp23可能是由

4、類似于文昌魚AmphiP23基因發(fā)生了基因倍增形成的。 Northem blot結(jié)果表明，AmphiP23在文昌魚成體組織中廣泛表達(包括脊索、鰓、肌肉、腸、精巢和卵巢)，相反，人p23在小鼠表達于除心臟和骨骼肌之外的所有組織(肝、腎、肺、胸腺、卵巢、脾和胃)，而人tsp23基因的表達則僅限于心臟和骨骼肌，這種人p23和tsp23在小鼠的互補表達圖式與Amphip23廣泛表達可能說明，p23在發(fā)生基因倍增形成p23和tsp23之

5、前，是廣泛表達，而到脊椎動物出現(xiàn)兩個基因和功能上的分化。原位雜交分析表明，AmphiP23在文昌魚早期神經(jīng)胚的近軸中胚層、脊索和神經(jīng)管開始表達，隨著神經(jīng)胚的發(fā)育，轉(zhuǎn)錄發(fā)生在體節(jié)中胚層和神經(jīng)管的前部，到一天幼蟲，AImphiP23在腦泡的背部、后部體節(jié)和表皮細胞中表達，而二天幼蟲則主要在腦泡表達，在身體的其它部分也有微弱信號，說明AmphiP23可能與前后軸形成有關(guān)。 利用原核表達系統(tǒng)表達并純化了文昌魚p23的融合蛋白，獲得了分子

6、量大約為22kDa的純化蛋白，N-末端測序表明蛋白表達正確。利用融合蛋白制備了多克隆抗體，Western blot結(jié)果表明，抗體能與文昌魚p23蛋白特異性雜交。另外，我們免疫組織化學的結(jié)果初步表明，p23在成體各種組織中分布，證明文昌魚p23蛋白在生物體內(nèi)是一個廣泛分布并具有多重功能的蛋白質(zhì)。 生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，p23蛋白是帶有較多凈負電荷的酸性蛋白，文昌魚p23蛋白具有p23蛋白大多數(shù)的特征性結(jié)構(gòu)，與其它p23蛋白的氨基酸序