文昌魚PAO基因的鑒定、表達和功能研究.pdf

1、多胺氧化酶(Polyamine oxidase, PAO)是單體的可溶性蛋白,FAD分子作為輔酶與PAO蛋白非共價結(jié)合,可以催化多胺和乙酰多胺的的氧化。因為多胺是細胞生長和分化的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)者,它們的體內(nèi)平衡對細胞生命是非常重要的。酵母菌的多胺氧化酶(PAO)可以氧化精胺(Spermine,Spm)、N1-乙酰精胺(N1-acetylSpm)和 N1-乙酰亞精胺(N1-acetylSpd)。在脊椎動物里,存在兩種不同的酶,即精胺氧化酶(Sp

2、ermine oxidase,SMO)和乙酰多胺氧化酶(N1-acetylpolyamine oxidase, APAO),可以特異性地分別催化精胺和N-乙酰精胺以及N-乙酰亞精胺的氧化。目前,在非脊椎動物中沒有關(guān)于PAO功能的研究,所以現(xiàn)在急需非脊椎動物PAO結(jié)構(gòu)和功能研究。頭索動物文昌魚,是介于脊椎動物與無脊椎動物之間的一個過渡物種,一直以來被認為是脊椎動物的祖先,也是研究脊椎動物起源和進化的重要模式生物。本文首次克隆得到了青島文昌

3、魚(Branchiostoma japonicum)的PAO基因(Bjpao),并對其進行了相關(guān)生物信息學分析和功能研究。
　　首先,對PAO進行了克隆、生物信息學分析和組織表達研究。我們克隆得到了長度為1428bp的BjPAO開放性閱讀框架(ORF)的序列,可編碼長度為475個氨基酸的蛋白質(zhì)(BjPAO),分子量約為52.0 kDa。該蛋白質(zhì)包含一個FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個多胺氧化酶多結(jié)構(gòu)域,具有已知物種SMO、APAO和PAO基

4、因的保守活性位點Trp62、His64、Lys301、Tyr412和Thr460,是典型的PAO家族成員。隨后,我們利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了Bjpao在各組織中的表達情況。Bjpao在脊索中的表達量最高,其次是精巢和卵巢,在后腸和肌肉中的表達量最低,表現(xiàn)出組織特異性。
　　其次,研究了BjPAO的生理功能。我們將文昌魚Bjpao基因插入到原核表達載體pET-28a中,然后將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌中進行體外大量誘導

5、表達,隨后對表達得到的蛋白進行純化和復性。對純化復性后的蛋白的底物特異性及酶活進行了檢測。結(jié)果顯示rBjPAO可以高效氧化精胺和亞精胺,而在氧化 N1-乙酰精胺時,效率很低。此外,我們還分析測定了 rBjPAO的 Km和Vmax值。
　　最后,我們使用定點突變的方法,研究了rBjPAO的活性位點。我們將rBjPAO中第64位的氨基酸H、第301位的氨基酸K和第460位的氨基酸T進行了突變,并構(gòu)建了 rBjPAO/H64Q、rBjP