青島文昌魚肌酸激酶基因的克隆、表達(dá)分析和功能研究.pdf

1、肌酸激酶(creatine kinase，CK)是磷酸原激酶家族的一員，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)。在從古老的海綿到脊椎動(dòng)物的很多物種中被鑒定。在脊椎動(dòng)物，當(dāng)機(jī)體組織病變或受到感染時(shí)，體內(nèi)CK活性迅速升高，但是在文昌魚中對(duì)于此類蛋白功能卻了解甚少。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動(dòng)物原始祖先最接近的頭索動(dòng)物，一直被認(rèn)為是研究脊椎動(dòng)物起源和進(jìn)化的模式動(dòng)物。本文從青島文昌魚(Branchiostoma belcheri)cDNA文庫中，

2、分離出具有完整編碼框的CK基因(BbCK)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。 首先，從文昌魚cDNA文庫中克隆到全長為1787 bp的BbCK cDNA，其最大開放閱讀框編碼379個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(理論分子量為43kDa)，無信號(hào)肽。該cDNA編碼的蛋白(BbCK)同脊椎動(dòng)物的CK一樣，具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：ATP：guanido phosphotransferase N-末端結(jié)構(gòu)域和ATP：guanido phosphotr

3、ansferase C-末端結(jié)構(gòu)域，其活性部位位于C-末端結(jié)構(gòu)域中，且都具有保守的CPSNLGT的序列。將BbCK同其他CK蛋白進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，CK同功酶家族極為保守，BbCK與其他物種的Mi-CK聚為一類。 其次，我們還研究了CK基因在文昌魚中的表達(dá)情況。切片原位雜交分析表明，BbCK在成體組織中廣泛表達(dá)，在肝盲囊和后腸中的表達(dá)量較高。 再者，對(duì)BbCK的功能進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素LPS處理文昌魚

4、后，BbCK基因表達(dá)水平迅速升高。因此，推測(cè)文昌魚CK可能是一種急性時(shí)相蛋白，參與宿主免疫防御。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BbCK的免疫功能，我們構(gòu)建原核表達(dá)載體，導(dǎo)入E.coli誘導(dǎo)表達(dá)。BbCK在包涵體中大量表達(dá)；經(jīng)透析復(fù)性后，純化出重組蛋白BbCK。用熒光標(biāo)記重組蛋白與細(xì)菌作用，發(fā)現(xiàn)它能夠與革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌結(jié)合；并且作了抗菌活性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)復(fù)性后重組蛋白BbCK對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌有一定的抑制作用，從另一個(gè)側(cè)面證明BbCK可能參與宿