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文檔簡介
1、絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,可調(diào)控多種生物學(xué)過程。TGF-β激活激酶-1(TAK1),也稱為絲裂原激活蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7),最初是作為MAPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶被發(fā)現(xiàn)的。TAK1通過介導(dǎo)激活核因子κB(NF-κB)、c-Jun氮末端激酶(JNK)和p38通路來應(yīng)對白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α和toll樣受體的刺激。TAB1(也就是TAK1結(jié)合蛋白)是蛋白激酶TAK1的
2、一個調(diào)節(jié)亞基,并且可以特異性的作用于TAK1氮末端從而直接誘導(dǎo)TAK1激酶活性。文昌魚在進化過程中作為無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡物種,位于脊索動物的底端,是研究脊椎動物免疫進化的重要材料。為了進一步的研究TAB1基因的功能和進化,本論文首次克隆了白氏文昌魚的TAB1基因,對該基因序列進行相關(guān)生物信息學(xué)分析,并且采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出了白氏文昌魚TAB1蛋白。通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TAB1基因的時空表達(dá)模式。實驗結(jié)果如下:
3、
(1)采用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆得到白氏文昌魚TAB1基因全長序列。TAB1基因全長為2281bp,其中ORF序列長度為1659bp,可編碼533個氨基酸,5'非翻譯區(qū)長度為89bp,3'非翻譯區(qū)長度為533bp。利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了PET32a-TAB1表達(dá)載體,通過原核表達(dá)實驗,IPTG低溫誘導(dǎo)6h后成功表達(dá)出大小為62KDa的特異性蛋白,進一步利用Anti-His tag抗體采用Western bl
4、ot方法初步驗證該特異蛋白就是重組表達(dá)的TAB1蛋白。
(2)白氏文昌魚TAB1基因相關(guān)生物信息學(xué)分析表明:文昌魚TAB1蛋白序列與其它物種之間相似性高;文昌魚TAB1基因組由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成;文昌魚TAB1基因序列含有一個特異的PP2Cc結(jié)構(gòu)域;與另外20個物種的TAB1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果表明白氏文昌魚TAB1位于無脊椎動物和脊椎動物之間且白氏文昌魚TAB1基因?qū)儆赥AB1基因家族。
(3)通
5、過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測文昌魚TAB1基因在鰓、肝盲囊、腸、肌肉、脊索和性腺等6個不同組織中的表達(dá)量情況,結(jié)果表明文昌魚TAB1基因在各個組織中都有表達(dá),且TAB1基因在性腺中的表達(dá)量最高,在肝盲囊、肌肉和脊索中的表達(dá)量相對較高,在鰓和腸中的表達(dá)量最低。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TAB1基因在LPS刺激后不同時間點(2h,4h,6h,8h,10h,12h,24h和48h)的表達(dá)量情況。結(jié)果表明文昌魚TAB1基因在6h時的相對表達(dá)
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